这项工作是具有特别提到希拉里工艺和道格拉斯·迈尔斯爵士支持帝国BRC，国家卫生研究院的研究，并采取行动战胜癌症。

程序如下一直道德经伦敦帝国学院。 1.原发性代微球体从人乳腺癌细胞系注：执行下无菌培养罩以下步骤。 <ol><li>制备微球体媒体​​含有DMEM / F12补充了2mM L-谷氨酰胺，100U / ml青霉素，100U / ml链霉素。 ，10纳克/ ml重组人碱性成纤维细胞生长因子（bFGF; R＆D系统）和1x B27添加剂;通过加入20纳克/ ml重组人表皮生长因子（Sigma公司，EGF）在使用前立即制备完整的媒体。 </li><li> （或您选择的乳腺癌细胞系; 70​​-80％汇合）从瓶中含有粘附MCF-7或MDA-MB-231细胞吸媒体报道，在1X PBS洗两次，trypsinize细胞。 </li><li>离心细胞，在200×g离心，在室温下放置5分钟。倒出上清和悬浮细胞在1-5毫升的微球体介质。移液器上下，如有必要，使用一个40微米的细胞滤网过滤帽，以获得单细胞悬浮液。使用血球计数器，以确保单细胞悬浮液已形成（如果不是，则使用将25g针注射器，所述细胞悬液最多3次）。 </li><li>如果通过FACS必要分离CD44 + CD24-细胞的子集使用抗CD24藻红蛋白（PE）和抗CD44异硫氰酸荧光素（FITC）的单克隆抗体9。可替代地，使用磁激活细胞分选（MACS）系统用抗CD44和抗CD24的生物素合成微珠按制造商的说明分离这样的人口。用LD柱进行正选择使用LS列，并阴性选择和流确认所有分离细胞的表型流式细胞仪17。 </li><li>计算使用台盼蓝每毫升的活细胞的数目。 注：细胞活力被计算为活细胞通过细胞的总数的网格内的hemocy划分的数目垢仪。这样会占用台盼蓝细胞被认为是非可行的。下面的过程是用来精确地确定活细胞的比例。 <ol><li>制备在PBS中的台盼蓝的0.4％的溶液。加入0.1毫升锥虫蓝原液到1ml细胞。加载血球和显微镜低倍率下的立即检查。计数总细胞数和蓝染色的细胞的数目。 活菌= [1.00 - （蓝色细胞数÷总细胞数）]×100。 </li><li>计算每毫升培养物的活细胞的数量，使用下面的公式。记以校正稀释因子。 活细胞数×10 4×1.1 =细胞/ ml培养</li></ol></li><li>悬浮预先确定的细胞量在2毫升完全微球体媒体​​在6孔超低附着板的各孔中。接种密度通常为500-4,000个细胞/厘米每孔2细胞。可选择使用LO瓦特附件24孔板而在0.5ml的培养基接种的细胞在相同的密度。 注：我们推荐接种密度和文化的时间优化每个感兴趣的细胞系。 </li><li>而不干扰所述板孵育超低附件6孔板，在37℃和5％的CO 2为5-10天（取决于细胞系和乳腺球的大小），特别是在第5天的生长期。 </li></ol> 2.原代微球体从人乳腺癌的临床样本注意：人乳腺癌组织中可从接受手术切除乳腺肿瘤的患者中获得。在冰上商店组织长达24小时的50毫升无菌试管中的培养基含有100U / ml青霉素和100U / ml链霉素。执行下一个无菌培养罩以下步骤。 <ol><li>将样品转移到一个100mm组织培养皿用小体积的介质。祛瘀e。使用无菌剪刀，scapel和镊子的脂肪组织。 </li><li>添加2-3毫升的DMEM / F12和剁碎的样品成1mm 3枚无菌scapel或刀片，直到没有大块依然存在。 </li><li>重悬的组织片在预热10毫升的DMEM含有蛋白水解酶（3000单位/毫升胶原酶和1000 U / ml的透明质酸酶），并在旋转振荡器孵育在37℃，直到所有的组织碎片被消化。通常完全消化需要1-3小时。根据肿瘤的病理特征调整消化时间。 （例如乳腺癌通常是难以消化相比，粘液癌是比较脆弱的，需要更短的消化时间）。通过观察下血球20微升悬架评估每一个消化半小时的程度。 </li><li>允许片段沉降5分钟，然后在200×g离心，在室温统转移上清液在一个15毫升的锥形聚丙烯管中并离心10分钟perature。小心倒出上清，悬浮细胞在1 - 5毫升微球体介质。 </li><li>按照上面描述的用于细胞系，以获得和板单细胞悬浮液中的步骤1.1-1.4。穿过25 G细胞如果需要的最大的2倍注射器限制破坏细胞。 </li></ol> 3.微球体形成率（％）计算<ol><li>培养期结束后，算上微球体（大于40微米）的直径在显微镜下放大40倍。数字图像5无规字段使用数码相机上的光显微镜并使用采集软件确定的微球体的大小。使用任何图像分析软件。 </li><li>使用以下等式计算乳腺球形成率（MFE％）： MFE（％）=（＃每孔微球体）/（＃细胞每孔接种）×100 </li></ol>微球体4.自我更新的评估连续传代<ol><li&gt;移液器含有来自每个井的微球体入15ml管中的介质。用PBS洗涤各孔，并加入到收集介质。离心在115×g离心，在室温下10分钟。 </li><li>弃上清，悬浮颗粒在500微升预热的0.5％胰蛋白酶/ 0.2％EDTA的。孵育2-3分钟。 </li><li>加入500微升的FCS以中和胰蛋白酶。离心，在500×g离心5分钟。弃上清，重新悬浮颗粒在100微升微球体介质，移液，上下分列球。 </li><li>计数细胞用血细胞计数器，并确定是否细胞是在单细胞悬浮液。如果不通过将25g注射器最多3次，以获得单细胞。种子的细胞进入一个新的超低附件6孔板在在初级代中使用的相同的密度。 </li><li>经过5-10天，算球&gt; 40微米，使用前报道的公式计算球体形成效率。 </li></ol>

<ol>
	<li>Iliopoulos, D., Hirsch, H. a., Struhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+epigenetic+switch+involving+NF-kappaB,+Lin28,+Let-7+MicroRNA,+and+IL6.">An epigenetic switch involving NF-kappaB, Lin28, Let-7 MicroRNA, and IL6.</a> Cell. 139 (4), 693-706 (2009).</li><li>Iliopoulos, D., Hirsch, H. a., Wang, G., Struhl, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inducible+formation+of+breast+cancer+stem+cells+and+their+dynamic+equilibrium+with+non-stem+cancer+cells+via+IL6+secretion.">Inducible formation of breast cancer stem cells and their dynamic equilibrium with non-stem cancer cells via IL6 secretion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (4), 1397-1402 (2011).</li><li>Visvader, J. E., Lindeman, G. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lineage+tracing+reveals+Lgr5++stem+cell+activity+in+mouse+intestinal+adenomas.">Lineage tracing reveals Lgr5+ stem cell activity in mouse intestinal adenomas.</a> Science. 337 (6095), 730-735 (2012).</li><li>Sheridan, C., Kishimoto, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD44+/CD24-+breast+cancer+cells+exhibit+enhanced+invasive+properties:+an+early+step+necessary+for+metastasis.">CD44+/CD24- breast cancer cells exhibit enhanced invasive properties: an early step necessary for metastasis.</a> Breast cancer research: BCR. 8 (5), R59 (2006).</li><li>Ginestier, C., Hur, M. 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K., Brain, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Don&#8217;t+look:+growing+clonal+versus+nonclonal+neural+stem+cell+colonies.">Don&#8217;t look: growing clonal versus nonclonal neural stem cell colonies.</a> Stem Cells. 26 (11), 2938-2944 (2008).</li><li>Stingl, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+analysis+of+mammary+gland+stem+cells.">Detection and analysis of mammary gland stem cells.</a> J Pathol. 217 (2), 229-241 (2009).</li><li>Kreso, A., Dick, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+of+the+cancer+stem+cell+model.">Evolution of the cancer stem cell model.</a> Cell stem cell. 14 (3), 275-291 (2014).</li><li>Al-Hajj, M., Clarke, M. 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The authors declare that there is no conflict of interest that could be perceived as prejudicing the impartiality of this article.

中小学微球体的成功评估依赖于细胞被镀在足够低的密度，从单一的克隆微球体的形式，以最小的领域聚集。然而，在密度过低，过少的微球体可能形成区分疗效的统计。播种密度应为使用，因为他们可以有很大的不同在他们的领域形成效率每个细胞系进行优化（那些表达低E-cadherin的可能形成不太稳定，短期微球体培养18）。这种优化阶段应确保从单细胞的克隆生长最初级和次级球形成?...

通过干细胞样肿瘤干细胞为首的肿瘤细胞系的存在，极大地增加我们的肿瘤异质性的理解。而在一些肿瘤的遗传多样性并从基因不同克隆的克隆产物出现，大幅组件出现从后生差异导致：癌细胞可以通过激活特定基因或抑制干，祖和分化状态之间转换（有时可逆）表达程序1 - 3。这可能反映了细胞的内在或外在的因素，这反映当前正从邻近癌，间质或免疫细胞递送调节因子表达与在与旁分泌信号结合其所得自分泌信号传导的细胞中的基因表达程序，microenviromental条件如度缺氧2,4,5。 虽然创新的谱系追踪的方法在前进我们研究推定的癌干细胞在它们的体内利基6能力-如图8所示 ，球形成测定法仍估计乳腺癌细胞的潜力，以行为像干细胞，至少在所用的测定条件一种流行和方便的方法。它经常被用来一起回顾性方法用于净化癌症干细胞，通过对已提出的膜标记物CD44和CD24 9，和酶乙醛脱氢酶（醛脱氢酶）的活性水平10，标志物的表达，以对应于更mesenchymal-和上皮分别为11样癌干细胞。球体的形成方法首先被开发作为神经球测定法，使得能够从单个克隆在非粘附，无血清条件，增加了上皮生长因子（EGF）12推定的干细胞的生长，后来被有效地应用于正常和癌乳腺组织。 骨真正的干细胞，认为休息G0期，将不会遇到的因素将有利于激活体内的精确组合。所述微球体测定代替使细胞要么蓄势有丝分裂或已经除以13的生长。这些祖细胞，虽然不是一个真正的静态细胞，可能是细胞阶段，与在测定中使用的表皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）促分裂原增殖。然而，它们包含了一系列激活干细胞相关的信令的通路14。另外，它们的形成的速率涉及当通过在有限稀释测定法效力在小鼠异种移植2,15,16测定它们取自组织的致瘤&lt;/ SUP&gt;。 在这里，我们提供详细的协议，以分离单个细胞，并产生来自人乳腺癌细胞系和乳腺肿瘤的临床样品初级乳腺球。我们还描述了如何执行主微球体的连续传代，以评估自我更新，以及如何计算球体形成效率，允许在不同的接种密度比较（见方案在图1中）。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1049">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:625px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:139px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/F12</td>
			<td style="width:139px;">Lonza</td>
			<td>CC-3151</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:625px;">2mM L-Glutamine</td>
			<td style="width:139px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>G8540</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:625px;">100U/ml Penicillin &#38; Streptomycin</td>
			<td style="width:139px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>P4083</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:625px;">20ng/ml recombinant human epidermal growth factor (EGF)</td>
			<td style="width:139px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>E9644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:625px;">20ng/ml recombinant human basic fibroblast growth factor (bFGF)</td>
			<td style="width:139px;">R&#38;D systems</td>
			<td>233-FB-025</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:625px;">1x B27 supplement&#160;</td>
			<td style="width:139px;">Invitrogen</td>
			<td>17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;">Phosphate buffered saline (PBS);</td>
			<td style="width:139px;">Thermo Scientific</td>
			<td>12399902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;0.5% trypsin-0.2%EDTA;</td>
			<td style="width:139px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>59418C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fetal Calf Serum</td>
			<td style="width:139px;">First Link UK</td>
			<td>02-00-850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;Trypan Blue</td>
			<td style="width:139px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>93595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">&#160;Low attachment 6 well plates</td>
			<td style="width:139px;">Corning</td>
			<td>CLS3814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Collagenase type 1A</td>
			<td style="width:139px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>C9891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Hyaluronidase</td>
			<td style="width:139px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>H3506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile razor blades</td>
			<td style="width:139px;">Fisher Scientific</td>
			<td>12443170</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:625px;">Sterile scalpel</td>
			<td style="width:139px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">11758353</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:625px;">Sterile micro-dissecting scissors</td>
			<td style="width:139px;">Sigma Aldrich</td>
			<td>S3146</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

mammosphere formation assay from human breast cancer tissues and cell lines

类似的健康组织，许多血液和实体恶性肿瘤现在认为是分层组织的，与干细胞样癌细胞自我更新而引起更加分化的后代的一个子集。理解并针对这些癌干细胞在乳腺癌，其可以具有增强化疗和放射抗性相比非干肿瘤散装，已成为一个重要的研究领域。该微球体检测也成为广泛使用的，因为它能够识别追溯sphere-：标志物CD44包括，CD24和乙醛脱氢酶的活性可以用荧光活化细胞分选（FACS）来隔离前瞻性当细胞植入免疫缺陷小鼠显示增强的致瘤性进行评估形成细胞，从单一的干细胞样克隆的发展。在这里，我们列出的微球体从细胞系或小学患者样本，他们的传代，并计算估计范围f显示相应的培养方法orming效率（SFE）。首先我们讨论关键的考虑和陷阱在适当的规划和微球体的实验解释。

不同的样品或那些经受不同处理可以在微球体&gt;40μm的用于接种的初始细胞正火后形成的数目而变化。计算乳腺球形成率（MFE），用于在一式三份培养各处理。这使得能够用不同的接种密度实验以进行比较。数据最好显示在一条形图，理想地与阳性和阴性对照，并显示在整个一式三份孔的标准偏差。始终在60-80％汇合之间粘附细胞转移到非粘附板。小心细胞计数是必不可少的准确定量的治疗效果?...

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Mammosphere Formation Assay from Human Breast Cancer Tissues and Cell Lines

Floating mammosphere assays can investigate the subset of stem-like breast cancer cells that survive in suspension conditions and show enhanced tumorigenesis when implanted into mice. This protocol provides a convenient in vitro measure of sphere-forming ability, a proxy for in vivo tumorigenesis, while facilitating analysis of the stem-associated transcriptional landscape.

从人乳腺癌组织及细胞系微球体形成分析

Similar to healthy tissues, many blood and solid malignancies are now thought to be organised hierarchically, with a subset of stem-like cancer cells that ...

mammosphere-formation-assay-from-human-breast-cancer-tissues-cell

Research

JoVE Journal

Medicine

33.0K 次观看.  Imperial College London. Floating mammosphere assays can investigate the subset of stem-like breast cancer cells that survive in suspension conditions and show enhanced tumorigenesis when implanted into mice. This protocol provides a convenient in vitro measure of sphere-forming ability, a proxy for in vivo tumorigenesis, while facilitating analysis of the stem-associated transcriptional landscape.