本文中描述的乳腺癌细胞球状体将允许研究人员研究参与癌细胞增殖和转移的癌细胞内皮细胞相互作用的分子机制。这种3D模型的主要优点是它提供了更逼真的细胞排列，提高了乳腺癌病理生理学和治疗的推理的可靠性。演示该过程的将是来自我实验室的博士生Giovanna Azzarito。
首先处理或转染接种的细胞24小时，或根据需要。为了识别球状体中的细胞分布，用一毫升含有钙和镁的Hanks'平衡盐溶液或HBSS洗涤细胞，并使用每毫升蓝色染料0.5微克留在HUVECs中。并将MCF-7细胞采用0.5微摩尔绿色染料稀释在生长培养基上。
将板放入37摄氏度和5%CO2培养箱中30至40分钟。用一毫升不含钙和镁的HBSS洗涤细胞。然后使用P1000移液管向每个棕色培养皿中加入一毫升酶分离剂，其中HUVEC为0.25%胰蛋白酶，4个MCF-7中为0.5%。。
在五毫升圆底聚苯乙烯管中分别选择每种细胞类型，并使用P1000移液管加入一毫升10%胎儿小牛血清或FCS培养基以停止酶促反应。然后将细胞悬浮液以250倍G离心五分钟。小心地吸出上清液并将细胞悬浮在一毫升不含类固醇的培养基中。
使用用10毫升稀释剂2稀释的每个细胞悬浮液的100微升来确定总细胞数。打开机器并通过按下功能和启动按钮进行冲洗，稀释剂2溶液在细胞计数器小瓶中。使用设置为四，然后按开始用新鲜的稀释剂2溶液测量坯料。
在10毫升稀释剂2溶液中用100微升细胞悬浮液更换闪烁小瓶。使用设置为四，然后按开始测量样品。在数字显示屏上记下每毫升的细胞数，然后准备每个细胞悬浮液的5毫升并混合它们以一比一的比例获得10毫升的最终体积，使用手动重复移液器将100微升的细胞悬浮液移出到96孔U底板的每个孔中。
将板置于标准组织培养条件下的培养箱中，并在48小时后检查球体形成。使用相差或荧光体视显微镜以40 X放大倍率拍摄该球体的照片。用于制备悬挂滴培养物的混合将细胞悬浮液以一比一的比例混合，以获得2毫升的最终体积。
使用P20移液器在10厘米培养皿的倒置铅上以15微升滴的形式观察细胞混合物。用滴剂倒置盖子，并在培养皿底部加入五毫升EBM-2基础培养基，以避免滴剂蒸发。将大约50个球体收集在1.5毫升的管中，其内脏尖端为P200微升移液器。
让它们通过重力沉降到管的底部，然后丢弃上清液。在室温下用500微升4%PFA固定该球体一小时。使用加热板在PBS中煮沸2%诺贝尔算法溶液，磁力搅拌三到五分钟，以完全溶解预兆粉末，并冷却至60摄氏度左右。
用P1000移液器去除PFA，用500微升PBS洗涤该球体并使其沉淀。沉降后，将上清液小心地将600微升的Agora溶液移入带有球体的1.5毫升管中，并立即将管放入具有177倍G的水平转子的离心机中两分钟。在Agro Solution的中间添加一根短绳，以轻松从管子上取下插头。
将Agros塞固化在冰上，或在4摄氏度下将500微升PBS加入1.5毫升管中，以避免颗粒变干。使用体视显微镜采集球体切片的图像。计算使用EBM-2以1至50的比例稀释的Aam钙和乙锭均聚体混合物每孔添加10微升所需的溶液量。
将染色混合物加入球状体中，并将板置于标准，组织培养条件下的培养皿中30至60分钟。使用荧光体视显微镜以40倍放大倍率获取图像。在U形底板中，在MCF七个细胞接种后48小时观察到球体的形成。
然而，在内皮细胞或淋巴细胞的情况下没有观察到球状体的形成。以一比一的比例接种MCF七加内皮细胞或MCF七加淋巴细胞也导致球状体形成。记录了MCF七个球体的时间依赖性顺序生长，范围从24小时到120小时不等。
在五天的时间里，球体的大小从大约100微米增加到大约200微米。在用生长刺激剂处理的球体中观察到生长速率增加。在Lipofectamine存在下，用对照寡核苷酸转染后，球状体的结构及其细胞的形状没有异常。
表达其增殖标记Ki-67的细胞均匀分布在该球体中。切开至半胱天冬氨酸酶三次染色后，这种球体的染色显示细胞在培养四天后出现冷漠。用CD-31和Ki-67研究该球体中的细胞显示，55%的细胞是上皮细胞，45%是内皮细胞，25%的细胞是增殖的。
为了评估活细胞和死细胞的百分比，用钙Aam和乙锭同源二聚体染色四天龄的球体。一种新鲜想到的球体也对死细胞和活细胞进行了染色，这表明球体对冷冻条件非常敏感。在遵循他的方案时，确保使用健康的细胞来混合阿佛洛狄忒 另一件要记住的事情是避免在DP帽期间损坏这些阿佛洛狄忒，以获得良好的切片，也确保在交叉聚合之前腭化阿佛洛狄忒。
通过包括其他细胞，例如参与肿瘤进展的成纤维细胞并使用它来评估靶向癌症生长的治疗剂的功效，可以进一步改进该模型。
