K.A.V. 和 P.A.A. 的工作得到了欧洲研究理事会 (EnergyBioCatalysis-ERC-2010-StG-258600)、工程和自然科学研究理事会 IB 催化剂奖 EP/N013514/1、生物技术和生物科学研究理事会 (BB/L009722/1 和 BB/N006321/1)。右侧得到了 Ministerio de Ciencia y Tecnologìa, 哥斯达黎加大学和林肯学院, 牛津。作者承认 Mr. 查理-琼斯, Mr. 查理. 埃文斯和机械车间 (化学系) 的工作人员, 协助设计和制造用于这项工作的电化学细胞。

1. 在厌氧、干手套和一般实验要求内重新创建 FTIR 光谱仪内部样品室
<ol><li>使用一种商用 FTIR 光谱仪, 配有外部汞镉碲化物检测仪和 ATR 附件。用干燥的空气或氮清除光谱仪的本体, 或者用光谱仪与疏散的光学工作台。</li>
	<li>将光谱仪放置在与厌氧 (< 1 ppm O2) 相同高度的稳定无振动表上, 干燥 (露点 <-75 ° c) 手套。将光谱仪的 ir 光束转移到手套, 通过一个足够大的红外透明窗口来容纳焦光束。 注意: 重要的是, 手套和光谱仪之间的空间也被清除或疏散, 特别是如果使用了例如氯化钠或 KBr 等吸湿窗口材料。</li>
	<li>
在手套内复制光谱仪的内部样品室。
	<ol>
<li>将手套内的光束定向到离轴椭球面镜上, 理想的焦距与光谱仪的内部聚焦镜的长度相同。 注: 在该聚焦镜前放置两个额外的平面镜是有用的, 以便在手套内调整 IR 光束的高度和方向;这将抵消光谱仪初始位置的任何不精确性。</li>
		<li>在手套内放置一个外部的检测器, 配以合适的聚焦光 (如短焦距 ZnSe 透镜或离轴抛物面镜, 短焦距), 定位于复制内部样品的尺寸分光计的隔间。</li>
		<li>调整红外光束的 "焦点", 使聚焦镜和检测器之间的距离大致相等。</li>
	</ol>
</li>
	<li>用液氮冷却外部检测器的杜瓦瓶。</li>
	<li>将 ATR 附件装入手套样品室。对准输入和输出聚焦光学和 ATR 配件, 以达到最大的吞吐量, 以交通部检测器。如有必要, 使用光圈或其他适当的衰减 (如电线网格), 以防止会的探测器信号。 注: 对于此处提供的数据, 使用所有反射光学和可拆卸梯形 Si 内反射元件 (愤怒) 的五反射 ATR 附件 (晶体 GmbH, 尺寸ca 5 x 8 x 1 mm3, 面角 39.5°)。愤怒是安装在一个可拆卸底板加工的聚醚醚酮 (PEEK)。</li>
	<li>使用手套来容纳重新创建的样本舱与适当的贯穿, 以允许连接到外部的电位 (气密的 BNC 连接是有用的这个目的), 天然气接入, 电缆 (s) 传送信号从交通部探测器.重要的是要保留任何屏蔽的探测器电缆, 以避免引入噪音或干扰的测量。</li>
	<li>放置一个蠕动泵, 能在手套内流速大于60毫升/分钟。在图 1中显示了光谱仪、ATR 附件、蠕动泵和电位设置的示意图。</li>
	<li>构造一个电化学单元格, 如在图 2中示意的那样, 它将密封在 ATR 附件上。该电池应包含高表面积的反电极 (Pt 线或纱布), 连接工作电极 (碳棒) 和微型参考电极。细胞应该包含至少二个进一步口岸作为入口和出口为迅速流动解答通过细胞。 注: 一个微型饱和甘参考电极是理想的为此目的。36
</li>
</ol>2. 用大肠杆菌修饰的炭黑微粒的制备氢1
<ol><li>在一个 ' 湿 ' 厌氧手套, 混合20毫克高表面积炭黑颗粒 (> 1000 m3/克) 与1毫升超纯水 (电阻率 > 18 ω cm) 在离心管。用低功率超声 (< 100 W) 将微粒分散到至少15分钟, 或直到色散均匀且不在1小时内沉积, 以提供大约20毫克/毫升的碳黑色弥散。</li>
	<li>
采取分的大肠杆菌氢 1 (Hyd1, 约50µL, 根据一个已发布的程序55) 在浓度为7毫克蛋白/毫升, 并交换到一个低离子强度缓冲区在 pH 接近等电点 (例如磷酸钾, 15 毫米, pH 5.8, 没有额外的盐)。为了取得最佳效果, 使用尽可能活跃的酶制剂。以浓度和稀释的方式进行缓冲交换, 在具有适当分子量截度的离心过滤装置中 (50 kDa 适用于 Hyd1)。
	<ol>
<li>将 Hyd1 添加到筛选器设备。</li>
		<li>稀释与大约450µL 交换缓冲。</li>
		<li>Reconcentrate 50 µL 使用轻度离心 (< ~ 2700 x g) 的体积, 以防止不可逆转的降水。</li>
		<li>重复步骤2.2.2 和2.2.3 直到缓冲区交换完成 (通常在5周期内)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>混合5µL 20 毫克/毫升炭黑分散体 (准备在 2.1) 与50µL 分的缓冲交换 Hyd1。将酶-颗粒混合物储存在冰箱 (在0° c) 过夜, 使酶吸附。有时可能需要摇动混合物以确保微粒保持分散。</li>
	<li>用低离子强度缓冲液 (磷酸钾, 15 毫米, pH 5.8, 没有额外的盐) 洗涤 Hyd1-modified 微粒在离心 (~ 2700 x g) 连续沉积和再分散循环。重复这个过程3-5 次, 以消除非吸附酶。 注: 在第一次洗涤前, 上清液应该是无色的, 表明对酶有良好的吸附作用。</li>
	<li>将微粒浓缩到5µL 的最后一卷, 以最终装载20毫克/毫升的酶修饰粒子。 注: 如果保持水合, Hyd1-modified 颗粒可贮存在4° c, 最多两周;这是最好的实现通过储存微粒稀释50µL 超纯水。</li>
</ol>3. 对大肠杆菌PFIRE 测量的准备氢1
<ol><li>用低动力的超声 (< 100 w) 清洗 Si 的怒气, 首先在 H2, 使4 (< 90% w/w) 为 ~ 15 min, 然后在硝酸3 (70% w/w) 中, 最多1小时。此清洗程序应导致亲水性的愤怒表面。如果需要进一步清洗, 愤怒可以放在食人鱼溶液中 (1:3 的比率为 h2O2: h2如此4) 来氧化任何剩余的有机物。 注: 苛刻的酸性清洗方法可能不适用于所有的愤怒材料。食人鱼溶液具有极强的腐蚀性和强烈的氧化剂, 在使用食人鱼溶液前应合理清洁表面, 并在制备和使用水虎鱼溶液时应注意, 这是由于过程的放热性质-总是添加 H2O2缓慢到 H2, 以便4 , 并参考有关准备、使用和处置的适当安全程序。</li>
	<li>用超纯水冲洗干净的怒火, 在干燥的氮气流下干燥。使用清洁镊子进行所有棱镜处理以避免污染。</li>
	<li>使用电子级硅酮密封胶的薄带将愤怒密封在 ATR 附件底板上。注意限制密封剂的边缘的愤怒。让密封胶完全干燥。</li>
	<li>将 atr 附件底板转移至光谱仪手套, 并将其安装在 atr 附件上。使用光谱仪的标准快速扫描模式和-1 平均干涉 (测量时间〜 1024-3 min), 测量在 4 cm5分辨率下的 4000-1000 cm-1之间的参考 (背景) 频谱。使用这一频谱作为输入, 允许计算吸收光谱后, 在实验。 注: 由于 Hyd1 活性部位的吸光度较小, 需要收集高信噪比的光谱。</li>
	<li>将 ATR 附件底板转移到 "湿" 手套, 其中包含预准备的 Hyd1-modified 颗粒分散体 (第2节)。投下1µL 分的粒子分散到大脸的愤怒, 并均匀地分散在表面上。注意: 不要让微粒变成完全干燥的愤怒。</li>
	<li>切割一张碳纸, 如在燃料电池中用作气体扩散层的材料, 尺寸〜0.1 毫米小于愤怒的表面尺寸 (即 ca 8.2 x 4.9 mm2)。碳纸的表面积应大到足以覆盖 Hyd1-modified 颗粒, 但不太大, 以重叠的硅胶密封胶用于确保愤怒。将碳纸浸泡在水中, 轻轻地将其放在颗粒膜的顶端。碳纸将在整个粒子膜上提供良好的电连接。 注: 预先准备好几张碳纸, 并将其预浸泡在 "湿" 厌氧手套内的超纯水中。</li>
	<li>装入电化学单元格 (在1.7 中描述, 在图 2中以示意的方法显示), 在愤怒的时候, 用螺丝将其固定在底板上。添加〜200µL 的实验缓冲区, 以保持酶的水合。一个混合的缓冲系统能够在宽 pH 值范围内进行缓冲, 对 NiFe hydrogenases 的研究是有用的:56乙酸钠, 2-[N'-吗] 乙烷-磺酸 (MES), n"-[2-羟乙基] 哌嗪-n-[2-乙烷-磺酸] (HEPES), n-三 [羟甲基] 甲基 3-氨基-丙烷-磺酸 (丝锥) 和 2-[N'-己] 乙烷磺酸 (棋), 每个成分在最后浓度为 15 mM 和含0.1 米氯化钠作为支持电解质, ph 值调整到 ph 6 使用浓碱液和 HCl。 注意: 工作电极的连接应在电化学电池顶部 (〜 0.1 mm) 的平面下方略微凸出, 以确保与碳纸 (图 2) 的电子连接良好。</li>
	<li>将电化学电池的溶液入口和出口连接到包含蠕动泵油管的流系统和实验缓冲器的一小瓶。将组装的电池转移到含有光谱仪的 "干" 手套。</li>
	<li>将电化学单元组件安装到 ATR 附件上。将工作、计数器和参考电极连接到电位。将蠕动泵油管连接到泵。</li>
	<li>使用在1000中收集的频谱作为参考/背景, 在 4000--1 cm3.4的光谱范围内记录1024平均干涉在 4 cm-1分辨率下的吸光度谱。在这一点上, 光谱应该包含显着 (> 100 mO.) 酰胺 II 波段在 ~ 1540 cm-1和活跃站点带 Hyd1 应该是明显的在光谱区域 1850-2150 cm-1, 主要在氧化, 不活泼的状态 (图3).</li>
</ol>4. 激活大肠杆菌氢1并检测电化学细胞
<ol><li>将减少电位 (−0.8 V vs SCE) 应用于 Hyd1-modified 粒子胶片。将实验缓冲区与 H2饱和, 并通过电化学单元缓慢地流缓冲。离开样品过夜, 充分激活 Hyd1。 注意: 使用厌氧 H2、N2 等是很重要的, 因此所有的厌氧气体都应该通过 O2过滤器来传递。</li>
	<li>在激活后记录样品的吸收光谱。活动站点的νCO和vCN带现在应显示减少的 "活动" 状态的分布。相对于 3.10 (图 4) 中记录的频谱, 使用差分频谱可以很容易地观察到这一点。</li>
	<li>测试电化学电池的电气连接。为此, 用 N2气体饱和实验缓冲区。应用氧化序列 (0 v vs sce), 并减少 (−0.8 v vs sce) 电位 ( ca 30 min 持续时间) 到 Hyd1-modified 粒子膜, 并记录每一个吸光度谱。Hyd1 应该迅速地被氧化并且减少, 并且, 如果微粒影片是好连接的100% 样品应该响应应用的潜力。</li>
	<li>设置实验缓冲器的适当流速。为此, 请将减少电位 (−0.8 V vs SCE) 应用于示例, 并使用 H2将实验缓冲区饱和。在10毫伏/秒的扫描速率下, 记录一系列循环伏安在-0.707-0.039 V vs SCE 之间. 逐渐增加伏安之间的 H2饱和缓冲区的流速, 直到催化波形类似于平面旋转圆盘电极55 , 最大电流与流量无关 (图 5)。 注: 水中 H2的溶解度极限为 ~ 0.8 mM, 在 293 K 和 1 bar。</li>
	<li>由于样品现在已经准备好进行 PFIRE 测量, 在一系列的溶液条件下 (pH, 温度, H2浓度等) 在一系列的电位范围内收集光谱。记录所有电化学数据使用电位软件, 因为它是重要的是能够关联光谱和电化学数据, 特别是在研究电催化过程, 如 H2氧化的 Hyd1。</li>
</ol>5. 光谱数据处理
<ol><li>通过在实验结束时记录 0 v 和−0.8 v vs SCE 的光谱, 确认活动站点在测量过程中没有被永久性地改变。这些应与在4.3 中记录的频谱相同, 并且在测量期间不应出现活动站点的丢失 (图 6)。</li>
	<li>用合适的格式 (. csv、ASCII、"matlab"、Jcamp等) 导出光谱仪软件的绝对吸收谱, 以便使用软件 (如原点或 matlab) 进行处理。</li>
	<li>
基线使用图 7中所示的过程更正数据。
	<ol>
<li>在 1800-2150 cm-1范围内的每个吸光度谱的第二个导数, 以识别小 (< 1 mO.) 活动的站点带对高弯曲的水背景。</li>
		<li>将基线标记点放在原始吸光度谱上, 并将点设置为 "捕捉" 到实验谱。</li>
		<li>使用插值三次样条函数或多项式函数, 通过点拟合基线。从实验数据中减去此基线函数。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

作者声明没有竞争的财政利益。

PFIRE 是一种广泛应用的红外光谱技术, 用于解决电极固定化的氧化还原蛋白。特别是, 在快速周转条件下, 可以探测氧化还原酶的电催化反应。PFIRE 方法是建立在直接电化学控制的基础上提供的 PFE 技术, 它提供没有直接的结构信息, 并与红外光谱在碳电极。因此, PFIRE 的方法增加了化学的洞察力, 仅从电化学中获得的信息, 非常适合研究氧化还原蛋白和参与小分子结合和活化的酶。此外, PFIRE 可以提供信息的潜在依赖性结构变化的蛋白质在没有催化周转。这种非周转的电子转移事件往往难以检测使用 "标准" 的应用 PFE, 虽然 PFE 扩展到傅里叶变换交流伏安法已成功地使用.45,46
PFIRE 方法, 原则上, 适合研究任何氧化还原蛋白, 可以研究使用 PFE。因此, 与 PFE, 蛋白质吸附是一个关键的步骤, 成功的 PFIRE 实验。在本协议中, 我们描述了一个应用的 PFIRE 技术使用大肠杆菌Hyd1 作为个案研究。36,43但是, 我们还将 PFIRE 技术应用于R. eutropha、44和黄素单吸附在炭黑上的细胞质调节氢。40在所有这些情况下, 对未被修改的高表面积炭黑的简单物理吸附 (如本协议所述) 提供了足够高的蛋白质表面覆盖率, 以记录高信噪比的高质量红外光谱。在无法达到如此高的吸附水平的情况下, 可能需要修改碳粒子的表面, 例如允许蛋白质与电极表面共价附着。60,61,62在研究必须处理厌氧的样本时, 仅严格需要使用手套进行 PFIRE 测量。然而, 在实践中, 极端恒定和低 (< 80 ° c 露点) 的水汽提供的手套大气的水平, 使高信号噪声水平, 允许提取非常小的吸收。44在许多情况下, 如手套提供的厌氧环境, 也需要电化学测量 (PFIRE 技术的积分), 以避免由于工作电极上的 O2减少而导致电流。
IR 吸收由于散装水, 实验缓冲器和碳粒子的样品被吸附所有贡献显着的实验谱, 并可能重叠的波段的兴趣, 特别是在酰胺 I, II 和 III 地区谱.63该酰胺区域还包含来自有机物种的信息, 如黄素或烟酰因子, 以及许多氧化和还原反应的基体和产品。在 NiFe hydrogenases 的情况下, 活动站点的νCO和νCN条带属于光谱中相对清晰的区域, 因此 PFIRE 技术非常适合于这些酶的研究。然而, 在其他情况下, 可能需要用不同的光谱和同位素标记方法来隔离由于固定化蛋白所引起的变化。类似的方法已被用来确定, 例如, 质子变化, 结构重和研究蔑氏配合使用红外光谱。64,65,因此, 66 PFIRE 不限于对 hydrogenases 的研究, 但可以应用于包含 (或其基质、产品或抑制剂含有) 具有诊断 IR 活性振动的组的任何氧化还原蛋白;例如, 一氧化碳 dehydrogeanses,67 nitrogenases,68,14 flavoproteins,40和甲酸脱氢。
SEIRA 的相关技术非常适合于仿生环境中膜相关蛋白的研究。32 SEIRA 是红外光谱的一种适应, 它也使用 atr-ir 配置, 并利用表面增强效应, 使位于靠近 (几 nm) 的分子的 ir 吸收度放大到 atr 棱镜 (愤怒) 的表面。因此, SEIRA 对在吸附的蛋白质和膜结构内发生的光谱变化非常敏感, 并且相对不受溶剂和基体/抑制剂在溶液中存在的竞争信号的影响。这与这里所描述的 PFIRE 技术相比是有些不同的, 它依赖于愤怒表面上明显更大的穿透深度 (〜1µm), 这意味着 PFIRE 对溶液中的基板、产品或抑制剂更敏感。这增加了对 ' 散装 ' 溶剂的敏感性可以是有利的;如果基材或产品可以直接通过 IR 观察, PFIRE 光谱报告的长期活种的稳态动力学和相关的产品形成在催化。69观察底物和产品的稳态浓度对诸如一氧化碳脱氢酶 (即催化 co 至 co 的可逆氧化反应的2、强 IR 吸收体) 的能力将特别有价值, 或甲酸脱氢酶 (催化甲酸可逆氧化为 CO2)。
目前, PFIRE 是有限的稳态动力学研究的酶催化由于宏观碳电极用于 ' 集中 ' 酶的表面上的愤怒的数据收集和 ATR-IR 几何。在这方面, PFIRE 对 NiFe hydrogenases 的研究是与戴尔和 co 工作者的工作互补的,49,50使用光触发瞬态吸收红外光谱来研究次周转动力学。正在进行的工作是小型化电化学单元格,40 , 并使用电极时间分辨率对微秒的顺序应该是可以实现的。这将有助于研究与营业额频率高达ca 100-500s-1的酶的次周转动力学, 并将有助于研究还原和氧化过程。
总的来说, PFIRE 是一种光谱学技术, 它允许在稳态条件下对氧化还原酶的电催化反应进行化学表征。PFIRE 方法允许在相同的酶样品上进行多种化学和电化学滴定, 因为所使用的高表面积电极提供了对蛋白质的强力吸附, 而 ATR-IR 几何允许简单的溶液交换。在酵素作用期间, 收集这样结构信息的能力在原位是一个可贵的工具为更加宽广的 bioelectrochemistry 社区。

在蛋白质功能研究中的一个关键挑战是发展的原位方法, 允许直接观察的蛋白质进行其生理作用, 无论是在体内或使用分离的蛋白质样本。这就要求将控制或触发过程集成到实验过程中, 并使用组合技术, 既可以评估反应性, 又能同时测量蛋白质功能中的个别化学步骤。在氧化还原蛋白的情况下, 这往往等同于结合电化学技术, 这恰恰控制了应用的潜力, 但没有提供直接的化学信息, 与光谱技术, 对化学特异性敏感与蛋白质功能相关的变化。1,2,3电化学是一系列耦合的电化学和光谱方法的通用术语, 包括各种光谱技术和电化学控制水平。许多蛋白质可以交换电子与人工, 可溶性电子捐助者和受体, 这已被利用的研究, 使用小分子调解电子转移, 包括与紫外可见的耦合,4,5,6, 7 磁性圆形二8及红外线5910111213波谱.在有限的数量的情况下, 它已被证明是可能的利用中介, 扩散控制的电子交换之间的蛋白质和电极。15,16
对于氧化还原酶进行的催化反应, 溶液电化学方法存在明显的缺点。扩散控制电子转移通过氧化还原介质在溶液中很可能成为速率限制。有关酶的动力学和机械信息可能会丢失, 或至少变得难以 deconvolute 从扩散文物产生的实验方法。因此, 直接、中介电化学控制是研究氧化还原蛋白和酶的重要工具。蛋白质膜电化学技术 (PFE) 采用电极固定化的氧化还原蛋白, 在这种方式下, 电子直接转移到或从氧化还原因子在蛋白质内, 因为电极是极化在一系列电位。17,18,19 PFE 对氧化还原酶的催化反应有特别的价值, 因为界面电子的转移可以以极高的速度实现。例如, 从Allochromatium vinosum中的镍铁 ([NiFe]) 氢的电催化周转率由 PFE 测量为ca 1000-1万 s− 1 , 用于 H2氧化。20电极电位作为触发催化 ' on ' 或 ' 关闭 ', 以及电催化当前的酶活性报告。因此, PFE 是一个很有价值的方法来分析复杂的酶的反应性密切依赖于潜力, 如反应的 di 铁活性部位的 [FeFe]-hydrogenases 与 CO 和 O2,21或潜在诱发失活反应的 hydrogenases,22一氧化碳脱氢酶,23和其他复杂的氧化还原酶。24
将光谱学技术与 PFE 提供的直接电化学控制相结合的主要障碍来自于氧化还原酶的低表面覆盖, 从A. vinosum中的 [NiFe] 氢的 1-2 pmol cm-2的顺序产生。20相对于原位表面科学研究小分子吸附在大块金属电极上的问题。这对光谱测量的灵敏度提出了挑战。在不同的电极上研究了固定化氧化还原蛋白的几种电化学方法: 透明金属氧化物电极上的紫外可见光谱;25,26,在金电极上的27荧光光谱;28,29表面增强红外吸收 (SEIRA) 在金电极上的光谱学;30,31,32,33和表面增强拉曼光谱技术, 主要是在银电极。34,35
在这里, 我们描述一种方法的耦合 PFE 与红外光谱, 在一个技术称为蛋白质膜红外电化学 (PFIRE)。36 PFIRE 方法研究了在高表面积碳工作电极上固定的氧化还原酶, 并结合衰减的全反射 ir (ATR-ir) 几何, 利用对碳表面上一系列蛋白质的吸附。红外光谱在氧化还原酶和蛋白质的研究中是有用的, 因为许多小分子, 配体和因子有诊断吸收, 可以用来评估反应性, 结合, 抑制和氧化还原状态。示例包括 NO 对铁硫中心的绑定,37 flavoproteins 的研究,38,39,40小分子绑定到血红素中心等。41 ATR-IR 几何允许构造一个优化的三电极 (分) 电化学电池42 , 从而提供优异的电化学控制。将参考电极置于工作电极附近可使溶液阻力和电位漂移最小化。使用高的表面积计数器电极, 与工作电极上的快速酶周转产生的高电催化电流相兼容。通过电化学细胞的溶液流动, 可以对基板、抑制剂和 pH 值的浓度进行简易控制。36,43,44因此, PFIRE 方法允许在持续酶催化期间将红外光谱记录到原位。36,44 PFIRE 还能够在没有催化电流的情况下提供化学信息,43与 PFE 相比, 在那里很难从氧化还原酶的非催化过程中提取信息。45,46
我们已经证明了 PFIRE 的方法, 研究的电催化 H2氧化的 [NiFe] hydrogenases, 其中含有内在 CO 和 CN 配体协调铁在一个双金属活性位点。36,43,因此, 44 [NiFe] hydrogenases 特别适合于 PFIRE。PFIRE 方法提供了关于在稳态流动期间存在的物种的信息, 因此提供了重要的机械洞察力, 除了在没有实验控制的 hydrogenases 红外光谱的文献的丰富。超过营业额。47,48戴尔和合作人员使用了时间解析的 IR 方法来研究 NiFe hydrogenases、49、50、51用一个轻触发器应用一个小的负电位步骤 (通过使用溶液介质和 "笼" 电子源) 或 photolyse 的束缚氢化物。虽然 PFIRE 方法目前不能提供时间分辨率来匹配这些测量值, 但40允许对还原和氧化催化过程进行研究, 并可在一系列定义良好的电位下访问, 而不需要大量运输限制.
PFIRE 方法有别于氧化还原蛋白的 SEIRA 研究, 它也使用 ATR 红外几何, 并采用纳米粗糙金属电极, 以提高吸附在电极表面的分子的 ir 吸收。30 SEIRA 是一种非常有价值的技术, 用于研究膜蛋白, 特别是在模拟膜体系结构中或在其内吸附,32 , 但对金属电极的需要可以限制由于反应性的基底和抑制剂范围对小分子的电极支持, 如 co、CN-, co2 等质子还原和自组装单分子膜解吸在极负电位的金属表面上可能有问题,1,52 , 尽管已报告无保护金属电极上的酶催化。53,54 PFIRE 相对于 SEIRA 的一个缺点是在本机或模拟膜结构中合并膜蛋白的相对困难。然而, 相对的化学惰性的碳电极的竞争小分子活化反应, 使 PFIRE 一个优秀的技术研究酶催化, 特别是在低电位领域与生物氧化还原过程, 如质子还原 hydrogenases。1,43
本文以 NiFe 氢 1 (Hyd1) 为例, 介绍了 PFIRE 法作为研究电极固定化氧化还原蛋白的技术. 讨论了样品制备、良好衬底流量的要求和数据处理。PFIRE 是一种广泛适用的技术, 非常适合研究任何氧化还原蛋白 (具有特征 IR 吸收), 可以吸附到碳电极上, 直接或使用表面修饰, 这样, 它可以交换电子与电极.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Spectrometer</td>
			<td style="width:71px;">Agilent</td>
			<td style="width:119px;">680-IR</td>
			<td style="width:167px;">with an external MCT detector</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">ATR accessory</td>
			<td style="width:71px;">Pike Technologies</td>
			<td style="width:119px;">GladiATR</td>
			<td>Customised for use with a 5-reflection Si IRE</td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">Glovebox</td>
			<td style="width:71px;">Glove Box Technology Ltd.</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Custom designed &#39;wet&#39; and &#39;dry&#39; box for anaerobic sample handling and measurement</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">KBr window</td>
			<td style="width:71px;">Crystran</td>
			<td style="width:119px;">Custom</td>
			<td>To allow coupling of the glovebox with the external beam of the FTIR spectrometer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Additional optics</td>
			<td style="width:71px;">Agilent</td>
			<td style="width:119px;">N/A</td>
			<td>Components from a PM-IRRAS accessory</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Silicon IRE</td>
			<td style="width:71px;">Crystal GmbH</td>
			<td style="width:119px;">Custom</td>
			<td>Trapezoidal: 8.4 mm x 5 mm (large face), 1 mm thickness, ca 39 degree face angle</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Potentiostat</td>
			<td style="width:71px;">Metrohm</td>
			<td style="width:119px;">Autolab PGSTAT 128N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Nova 10.1</td>
			<td style="width:71px;">Metrohm</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Software for controlling the potentiostat</td>
		</tr>
		<tr height="126">
			<td height="126" style="height:126px;width:216px;">Peristaltic pump</td>
			<td style="width:71px;">Williamson Manufacturing Company Ltd</td>
			<td>QL-1000-024-300</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Pt wire</td>
			<td style="width:71px;">Surepure Chemetals</td>
			<td align="right" style="width:119px;">3272</td>
			<td>99.95% Pure Platinum Wire, 0.014 inch Diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Carbon rod</td>
			<td style="width:71px;">WH Smith</td>
			<td align="right">30729209</td>
			<td>0.7 mm HB pencil lead</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Carbon black</td>
			<td style="width:71px;">Cabot Corporation</td>
			<td style="width:119px;">Black Pearls 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Ultrasonic bath</td>
			<td style="width:71px;">Ultrawave</td>
			<td style="width:119px;">U100</td>
			<td>35 W</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Centrifugal filter</td>
			<td style="width:71px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:119px;">UFC5050BK</td>
			<td>Amicon Ultra, 50 KDa MW cutoff</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Microcentrifuge</td>
			<td style="width:71px;">Eppendorf</td>
			<td align="right" style="width:119px;">5452000018</td>
			<td>MiniSpin</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">NaCl</td>
			<td style="width:71px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:119px;">71376</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">H2SO4</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">S/9240/PB17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HNO3</td>
			<td style="width:71px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">N/2300/PB17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:216px;">silicone sealant</td>
			<td style="width:71px;">Cow Corning Toray Co., Ltd.</td>
			<td style="width:119px;">SE 4486</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Carbon paper</td>
			<td style="width:71px;">Toray</td>
			<td style="width:119px;">TGP-H-030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">H2 gas</td>
			<td style="width:71px;">BOC</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">N2 gas</td>
			<td style="width:71px;">BOC</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">OriginPro 2015</td>
			<td style="width:71px;">OriginLab</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Data analysis/graphing software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Resolutions Pro 4.0</td>
			<td style="width:71px;">Varian</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Software for controlling FTIR spectrometer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protein film infrared electrochemistry demonstrated for study of h2 oxidation by a [nife] hydrogenase

理解氧化还原蛋白的化学需要的方法, 提供精确的控制在蛋白质的氧化还原中心。蛋白质膜电化学技术, 即在电极表面固定蛋白质, 使电极取代生理电子捐献者或受体, 为不同的氧化还原反应提供了功能性洞察蛋白质.充分的化学理解需要电化学控制与其他技术相结合, 可以增加结构和机械的洞察力。在这里, 我们演示了一种技术, 蛋白质膜红外电化学, 它结合了蛋白质膜电化学和红外光谱取样的氧化还原蛋白。该技术采用多反射衰减总反射率几何来探测在高表面积炭黑电极上固定的氧化还原蛋白。将此电极并入流动单元, 可以在测量过程中改变溶液 pH 值或溶质浓度。这是特别强大的解决氧化还原酶, 在那里的快速催化周转可持续和控制的电极, 允许光谱观察长期居住的中间物种的催化机制。我们演示了在营业额 (H2氧化) 和非周转条件下的大肠杆菌氢1的实验技术。

图 1显示了用于 PFIRE 测量的光谱仪、手套、ATR 附件、电位和气体流系统的实验安排的示意图表示。图 2显示了电化学单元格的代表性绘图。
图 3显示了 Hyd1-modified 粒子的吸光度谱, 实验缓冲器 (一个混合缓冲系统, 描述在 3.7, pH 6.0) 流经电化学细胞。在图 3中所示的示例中, Hyd1 的表面覆盖率特别高, 具有 235 mO D 的酰胺 II 波段强度。和最小的 ' 散装 ' 水, 证明的大小的 O H 伸展区域 (〜 3000-3600 厘米-1) 相对于带在〜1640厘米-1, 这是一个卷积的酰胺 I 波段的 Hyd1 和水 h O h 弯。在 C H 拉伸区域 (ca 2900 cm-1) 中可以看到由于该蛋白质而附加的带区。围绕 2100 cm-1的宽频带是 h O h 弯曲振动的组合带, 具有一组较低的能量振动带, 这是由于液态水中的氢键网络对 h2O 分子的限制旋转。活动站点的氧化、非活动、Ni-b 状态的νCO带清楚地显示在 1943 cm-1上, 即使没有基线校正, 并且νCN功能在2,050-2、100 cm-1 之间清晰可见。.在高 Hyd1 覆盖面, 许多微孔结构炭黑影片57变得由酵素阻拦, 因此 ' 散装 ' 水集中在 PFIRE 测量期间被降下。
图 3中的光谱显示, 在激活之前, Hyd1 薄膜中含有 Hyd1 在氧化、非活动状态。在 H2大气层下过夜的−0.8 V vs SCE 的激活导致了还原的、催化的活动状态的形成, 如图 4所示, 它显示了已激活 (减少)减去as 准备 (氧化) 差分谱Hyd1。使用νCO区域可以最清楚地解释 Hyd1 的差分光谱。活动站点的每个唯一状态与两个 CN 频带相比只有一个 CO 波段, 因此νCN区域在本质上更加复杂, 具有许多重叠的频带。在图 4中的差分频谱显示, 激活导致氧化、不活泼的镍硼的损耗 (负吸收带) 和少量的 ni 硅 (最氧化的 "活性" 状态), 这是存在于准备的 Hyd1 膜。这些被 Hyd1 的 ' 活跃 ' 状态替换;镍-碳-镍-r 和镍-l 注意到, 有两种形式的镍-r 和镍-l 状态, 这证明了两个νCO带观察到这些物种在图 4。对多个镍-R 和镍-L 状态的观察与其他 NiFe hydrogenases 是一致的。48,58,59
PFIRE 方法的一个关键验证是, 电化学流细胞内的 Hyd1 记录的循环伏安显示了类似的催化波形, 记录在平面旋转圆盘电极上。55在实践中, 这意味着基板 (h2) 和产品 (h+) 到/从固定的 Hyd1 在电化学单元中的质量传输是高效率的在 PFIRE 测量期间使用的流速。流速对催化波形的影响显示在图 5中, 它显示了在 H2大气 (1 bar) 下记录的连续伏安, 因为通过电化学电池的溶液流速增加了。在所有情况下, 过为 H2氧化的 Hyd1 是相同的 (红色阴影矩形), 但氧化失活的程度 (滞后之间的电流在氧化和还原扫描的电位在ca 0 V与SCE) 和最大值 H2氧化电流依赖于溶液流速。在流速超过52毫升/分钟 (浅灰色伏安) 的催化波形是不敏感的进一步流速增加。
图 6比较了在 0 V vs SCE (如4.3 所述的 Ar 大气下) 和厌氧氧化失活下的初始活化和厌氧再氧化后, 镍 B 状态的νCO 带的相对强度Ar 大气在 0 V vs SCE 后48小时的连续实验 (如5.1 所述)。在测量过程中, 不存在活动站点频带强度的损失, 所有的 Hyd1 样本都是对应用电位的响应。
图 7演示了整个工作中使用的基线校正过程。活动站点区域 (图 7a) 中的 Hyd1 样本的绝对频谱包含由于水而造成的显著曲率。事实上, 使用水作为溶剂的要求是大多数红外光谱在生命科学中应用的一个问题。绝对频谱的第二个导数 (图 7b), 使用带有 Savitsky Golay 平滑度9点窗口的原始软件计算, 可用于在曲线背景下识别 Hyd1 活动站点的锐带。使用第二导数谱识别近似峰值位置允许基线锚点放置在无活动站点频带的绝对频谱区域中 (图 7a中的圆圈)。然后, 通过这些定位点来拟合三次样条函数, 以创建基线函数, 然后从绝对频谱中减去基线校正的频谱, 仅包含 Hyd1 活动站点产生的峰值 (图 7c)。
图 8显示了 PFIRE 测量在 Hyd1 上的结果, 在非周转 (Ar 大气) 和营业额 (H2大气) 条件下, 在一个潜在的范围内。36当前时间跟踪 (图 8a) 报告每个应用电位的催化电流, 并在非周转条件 (Ar 大气) 下保持接近零电流。部分电化学氧化还原滴定在图 8b因此报告了活性部位的平衡氧化还原行为, 表明在没有催化周转的情况下, 每个潜在的国家的分布情况。图 8c中的光谱记录在翻转条件下 (在 h2大气下), 因此, 表示在催化 H2氧化过程中存在的活动站点状态的稳态分布 Hyd1。这一稳态条件得到证实的事实是, 催化 H2氧化电流 (图 8a、h2) 在−0.199 v 和−0.074 v vs她的时间函数中保持不变;在当前的单调衰变在 +0.356 V vs她是由于众所周知的厌氧氧化失活 Hyd1。55活动站点状态的分布在 Ar 和 H2的所有电位下都明显不同, Hyd1 执行催化作用 (图 8b, 光谱在−0.199, −0.074 和 +0.356 V vs她)。在 Ar 和 H2下记录的光谱在−0.594 V vs中几乎是相同的, 但是这是实验一致性的一个重要测试;Hyd1 不减少 H+在 pH 值 6.0 (当前在图 8a中, 在 Ar 和 H2下都接近于零), 因此在−0.594 V 的光谱预计是相同的。
图 9演示了 Hyd1 via的厌氧氧化失活在当前时间跟踪记录的灰色时间间隔内, 在 H2氧化过程中, 在 +0.356 v36光谱中, 镍-SI 的形成在图 9a中。在−0.074 V Hyd1 不进行氧化失活, 并且在整个潜在的步骤中, 活动站点状态的分布保持不变。这由图 9bi中的光谱来演示, 它在−0.074 电位步骤的开始处报告绝对基线校正的频谱, 而图 9bii在以后录制在潜在步骤中的时间, 并报告为相对于图 9bi的差分频谱。图 9biii和biv 中的光谱也被报告为相对于图 9bi的差分谱, 并显示了在高电位下镍硅的渐进转换失活, 与图 9a中的 +0.356 V 中显示的当前单调递减一致。
在溶液 pH 值范围内记录的光谱在 Hyd1 催化循环过程中能洞察质子的转移步骤。43图 10a显示在 ph 值3.0 和 ph 值9.0 的同一 Hyd1 胶片上记录的 PFIRE 光谱, 使用电化学细胞中的溶液流来交换实验缓冲器。在这两种光谱中, 镍-碳和镍-L 态的相对浓度明显不同。通过改变非周转条件下的应用电位, 可以在 ph 值 (图 10b) 范围内快速确定 NiC 和镍 L 状态的潜在依赖性, 并且发现这两个状态在宽 ph 范围内是等的。(请注意,图 10b中的峰值吸收只显示了透明的镍-碳和镍 L 状态, Hyd1 的完整氧化还原滴定已被伊达尔戈et al.) 报告36可以提取镍-碳和镍-l 浓度的 ph 滴定, 并以峰值吸光度为最高, 在每个 ph 值 (图 10c) 中, 其最大值为镍-碳和镍 l 浓度。通过这种方法, 并结合 EPR 数据, 确定了镍-碳和镍-L 态之间的 pH 平衡。43
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55858/55858fig1.jpg"> 图 1:红外光谱仪、厌氧手套、ATR 附件、检测器、气体流量系统和 PFIRE 测量用电位的排列示意图<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55858/55858fig1large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55858/55858fig2.jpg"> 图 2:用于 PFIRE 测量的电化学单元的示意图, 显示电极的排列和溶液入口/出口的连接.该电池和底板是由聚醚醚酮 (PEEK) 加工而成的, 其螺孔为碳棒工作电极连接、Pt 焊丝计数器电极、饱和甘参考电极以及溶液入口和出口。饱和甘参考电极结构如前所述。36<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55858/55858fig2large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55858/55858fig3.jpg"> 图 3: Hyd1-modified 炭黑微粒的吸收谱, 用缓冲器沉积在愤怒和水化上.介绍了酰胺 i 波段、酰胺 II 波段和 Hyd1 活性部位的位置, 以及由于 C H 拉伸振动和溶剂水的附加特性。该插图显示了活动站点区域的放大视图, 并带有标记的vCO和vCN带。' 预准备 ' 粒子含有 Hyd1 主要在氧化, 不活泼的镍 B 状态。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55858/55858fig3large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55858/55858fig4v2.jpg"> 图 4: 激活 Hyd1 在−0.8 V vs在 H2气氛下的 SCE, 呈现为减少的减去氧化差分谱.当低电位活化氧化, 不活泼的镍硼 (和小浓度的镍硅) 转换为更减少, 活性态镍-碳, 镍 r 和镍-l 注意到 Hyd1 有两个不同的亚态的镍-l 和镍-r。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55858/55858fig4v2large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55858/55858fig5.jpg"> 图 5: 溶液流速对电化学细胞中记录的催化循环伏安波形的影响.伏安被记录在增加的流量率 H2-饱和缓冲区的指示。在流速为20毫升/分钟 (红色) 的伏安显示显着失活超过 0 V vs她在向前扫描。在52毫升/分钟以上的流速下, 失活程度大大降低, 电流与所有电位的流速无关。其他参数: 1 bar H2, 10 毫伏/秒扫描速率。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55858/55858fig5large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55858/55858fig6.jpg"> 图 6: 在活动站点中校正红外光谱的基线νCO 区域氧化, 不活泼的 Ni B 状态在 0 V vs SCE.在连续的 PFIRE 测量过程中, 在48小时内没有可测量的活性场地强度损失, 因此 Hyd1 吸附在炭黑颗粒上。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55858/55858fig6large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55858/55858fig7.jpg"> 图 7:用于数据处理的基线更正过程的详细信息.基线锚点放置在活动站点区域 (a) 的绝对吸收谱上, 注意避免任何νCO和νCN从第二个导数分析 (b) 中识别的峰值。所得到的基线校正频谱显示在 (c) 中。<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55858/55858fig7large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55858/55858fig8.jpg"> 图 8:在非周转 (Ar) 和营业额 (H2) 条件下对 Hyd1 进行 PFIRE 测量.(a) Hyd1 在 Ar 饱和 (灰色) 和 H2饱和 (黑色) 缓冲区中的电化学单元中的电流时间痕迹;(b), (c) PFIRE 在 Ar (b) 和 H2 (c) 下显示νCO区域的频谱。在 V vs中引用的电位。伊达尔戈et al.的权限复制35<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55858/55858fig8large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55858/55858fig9.jpg"> 图 9:Hyd1 的厌氧灭活通过镍-硅中的镍-硼的形成.(a) 在 H2大气下的当前时间跟踪, 显示在−0.074 v 上的稳定电催化电流和缓慢的厌氧失活 (电流中的单调递减) 在 +0.356 v vs她。(b) 在 (a) 中标记的灰色阴影区域中记录的频谱。频谱 bi是在−0.074 V 势步长开始处记录的基线校正谱。频谱 bii, 在−0.074 V 步的稍后时间记录, 被报告为相对于 bi的差分频谱, 并显示活动站点状态的分布没有发生变化, 这与−0.074 v 的潜在稳定性一致。光谱 biii和 biv也被报告作为区别光谱相对于 bi并且显示镍 SI 的逐渐转换在厌氧失活期间在 +0.356 V 与她. 伊达尔戈et al.的权限复制35<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55858/55858fig9large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55858/55858fig10.jpg"> 图 10: 在溶液 pH 值范围内记录的光谱在 Hyd1 催化循环过程中提供了对质子转移步骤的洞察力.(a) 红外光谱显示νCO区域的 Hyd1, 记录在 ph 值 3.0 (-54 mv vs她) 和 ph 9.0 (-334 mv vs她)。(b) 进行电化学滴定, 以确定镍-碳和镍 L 浓度在溶液 pH 值范围内的最大电位。只有镍-C 和镍 L 浓度显示的清晰, 为一个完整的电化学滴定 Hyd1 见伊达尔戈et al.36 (c) pH 值依赖性镍-碳和镍-L 的相对浓度, 由一系列实验确定, 如 (b) 所示。光谱记录在20° c。改编自墨菲et al.的权限42<a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55858/55858fig10large.jpg" target="_blank">请单击此处查看此图的较大版本.</a>

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Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

在这里, 我们描述了一种技术, 蛋白质膜红外电化学, 使固定化氧化还原蛋白的研究光谱在直接电化学控制的碳电极。单个蛋白质样品的红外光谱可以在一系列的应用电位和各种溶液条件下记录。

用 [NiFe] 氢对 H2氧化的研究表明, 蛋白质膜红外电化学

Understanding the chemistry of redox proteins demands methods that provide precise control over redox centers within the protein. The technique of protein ...

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein Film Infrared Electrochemistry Demonstrated for Study of H2 Oxidation by a [NiFe] Hydrogenase

12.1K 次观看.  University of Oxford, Inorganic Chemistry Laboratory. 在这里, 我们描述了一种技术, 蛋白质膜红外电化学, 使固定化氧化还原蛋白的研究光谱在直接电化学控制的碳电极。单个蛋白质样品的红外光谱可以在一系列的应用电位和各种溶液条件下记录。

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Fluorescence Anisotropy as a Tool to Study Protein-protein Interactions

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is necessary to characterize it at the structural and mechanistic level. Several biochemical and biophysical methods exist for such purpose. Among them, fluorescence anisotropy is a powerful technique particularly used when the fluorescence intensity of a fluorophore-labeled protein remains constant upon protein-protein interaction. In this technique, a fluorophore-labeled protein is excited with vertically polarized light of an appropriate wavelength that selectively excites a subset of the fluorophores according to their relative orientation with the incoming beam. The resulting emission also has a directionality whose relationship in the vertical and horizontal planes defines anisotropy (r) as follows: r=(IVV-IVH)/(IVV+2IVH), where IVV and IVH are the fluorescence intensities of the vertical and horizontal components, respectively. Fluorescence anisotropy is sensitive to the rotational diffusion of a fluorophore, namely the apparent molecular size of a fluorophore attached to a protein, which is altered upon protein-protein interaction. In the present text, the use of fluorescence anisotropy as a tool to study protein-protein interactions was exemplified to address the binding between the protein mutated in the Shwachman-Diamond Syndrome (SBDS) and the Elongation factor like-1 GTPase (EFL1). Conventionally, labeling of a protein with a fluorophore is carried out on the thiol groups (cysteine) or in the amino groups (the N-terminal amine or lysine) of the protein. However, SBDS possesses several cysteines and lysines that did not allow site directed labeling of it. As an alternative technique, the dye 4&#39;,5&#39;-bis(1,3,2 dithioarsolan-2-yl) fluorescein was used to specifically label a tetracysteine motif, Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys, genetically engineered in the C-terminus of the recombinant SBDS protein. Fitting of the experimental data provided quantitative and mechanistic information on the binding mode between these proteins.

Protein interactions are at the heart of a cell&#39;s function. Calorimetric and spectroscopic techniques are commonly used to characterize them. Here we describe fluorescence anisotropy as a tool to study the interaction between the protein mutated in the Shwachman-Diamond Syndrome (SBDS) and the Elongation factor-like 1 GTPase (EFL1).

荧光各向异性作为一种工具来研究蛋白质相互作用

Protein-protein interactions play an essential role in the function of a living organism. Once an interaction has been identified and validated it is ...

科研

生物化学

Measuring Protein Binding to F-actin by Co-sedimentation

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, cross-linking and/or disassembly. This protocol describes a technique &#8211; the actin co-sedimentation, or pelleting, assay &#8211; to determine whether a protein or protein domain binds F-actin and to measure the affinity of the interaction (i.e., the dissociation equilibrium constant). In this technique, a protein of interest is first incubated with F-actin in solution. Then, differential centrifugation is used to sediment the actin filaments, and the pelleted material is analyzed by SDS-PAGE. If the protein of interest binds F-actin, it will co-sediment with the actin filaments. The products of the binding reaction (i.e., F-actin and the protein of interest) can be quantified to determine the affinity of the interaction. The actin pelleting assay is a straightforward technique for determining if a protein of interest binds F-actin and for assessing how changes to that protein, such as ligand binding, affect its interaction with F-actin.

This protocol describes a method to test the ability of a protein to co-sediment with filamentous actin (F-actin) and, if binding is observed, to measure the affinity of the interaction.

通过共沉淀测量蛋白与F-肌动蛋白的结合

Filamentous actin (F-actin) organization within cells is regulated by a large number of actin-binding proteins that control actin nucleation, growth, ...

Biotinylated Cell-penetrating Peptides to Study Intracellular Protein-protein Interactions

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The modification presented includes the combination of this technique with cell-penetrating sequences. We propose to design cell-penetrating baits that can be incubated with living cells instead of cell lysates and therefore the interactions found will reflect those that occur within the intracellular context. Connexin43 (Cx43), a protein that forms gap junction channels and hemichannels is down-regulated in high-grade gliomas. The Cx43 region comprising amino acids 266-283 is responsible for the inhibition of the oncogenic activity of c-Src in glioma cells. Here we use TAT as the cell-penetrating sequence, biotin as the pull-down tag and the region of Cx43 comprised between amino acids 266-283 as the target to find intracellular interactions in the hard-to-transfect human glioma stem cells. One of the limitations of the proposed method is that the molecule used as bait could fail to fold properly and, consequently, the interactions found could not be associated with the effect. However, this method can be especially interesting for the interactions involved in signal transduction pathways because they are usually carried out by intrinsically disordered regions and, therefore, they do not require an ordered folding. In addition, one of the advantages of the proposed method is that the relevance of each residue on the interaction can be easily studied. This is a modular system; therefore, other cell-penetrating sequences, other tags, and other intracellular targets can be employed. Finally, the scope of this protocol is far beyond protein-protein interaction because this system can be applied to other bioactive cargoes such as RNA sequences, nanoparticles, viruses or any molecule that can be transduced with cell-penetrating sequences and fused to pull-down tags to study their intracellular mechanism of action.

This is a protocol to study intracellular protein-protein interactions based on the biotin-avidin pull-down system with the novelty of combining cell-penetrating sequences. The main advantage is that the target sequence is incubated with living cells instead of cell lysates and therefore the interactions will occur within the cellular context.

化细胞穿透肽研究胞内蛋白-蛋白质相互作用

Here we present a protocol to study intracellular protein-protein interactions that is based on the widely used biotin-avidin pull-down system. The ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing approaches suffer from significant limitations, we have developed a new method for determining TF-DNA binding affinities with high sensitivity on a large scale. The assay relies on the established fluorescence anisotropy (FA) principle but introduces important technical improvements. First, we measure a full FA competitive titration curve in a single well by incorporating TF and a fluorescently labeled reference DNA in a porous agarose gel matrix. Unlabeled DNA oligomer is loaded on the top as a competitor and, through diffusion, forms a spatio-temporal gradient. The resulting FA gradient is then read out using a customized epifluorescence microscope setup. This improved setup greatly increases the sensitivity of FA signal detection, allowing both weak and strong binding to be reliably quantified, even for molecules of similar molecular weights. In this fashion, we can measure one titration curve per well of a multi-well plate, and through a fitting procedure, we can extract both the absolute dissociation constant (KD) and active protein concentration. By testing all single-point mutation variants of a given consensus binding sequence, we can survey the entire binding specificity landscape of a TF, typically on a single plate. The resulting position weight matrices (PWMs) outperform those derived from other methods in predicting in vivo TF occupancy. Here, we present a detailed guide for implementing HiP-FA on a conventional automated fluorescent microscope and the data analysis pipeline.

Here we present a novel method for determining binding affinities at equilibrium and in solution with high sensitivity on a large scale. This improves the quantitative analysis of transcription factor-DNA binding. The method is based on automated fluorescence anisotropy measurements in a controlled delivery system.

荧光显微镜竞争滴定法测定转录机-dna 结合感的高灵敏度

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Single Liposome Measurements for the Study of Proton-Pumping Membrane Enzymes Using Electrochemistry and Fluorescent Microscopy

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used for ATP production. The amphiphilic nature of membrane proteins requires particular attention to their handling, and reconstitution into the natural lipid environment is indispensable when studying membrane transport processes like proton translocation. Here, we detail a method that has been used for the investigation of the proton-pumping mechanism of membrane redox enzymes, taking cytochrome bo3 from Escherichia coli as an example. A combination of electrochemistry and fluorescence microscopy is used to control the redox state of the quinone pool and monitor pH changes in the lumen. Due to the spatial resolution of fluorescent microscopy, hundreds of liposomes can be measured simultaneously while the enzyme content can be scaled down to a single enzyme or transporter per liposome. The respective single enzyme analysis can reveal patterns in the enzyme functional dynamics that might be otherwise hidden by the behavior of the whole population. We include a description of a script for automated image analysis.

Here, we present a protocol to study the molecular mechanism of proton translocation across lipid membranes of single liposomes, using cytochrome bo3 as an example. Combining electrochemistry and fluorescence microscopy, pH changes in the lumen of single vesicles, containing single or multiple enzyme, can be detected and analyzed individually.

电化学和荧光显微镜在质子泵膜酶研究中的单脂质体测定

Proton-pumping enzymes of electron transfer chains couple redox reactions to proton translocation across the membrane, creating a proton-motive force used ...

Analysis of Protein Folding, Transport, and Degradation in Living Cells by Radioactive Pulse Chase

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and the degradation of target proteins in live cells. By using short (pulse) radiolabeling times (&lt;30 min) and tightly controlled chase times, it is possible to label only a small fraction of the total protein pool and follow its folding. When combined with nonreducing/reducing SDS-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and immunoprecipitation with (conformation-specific) antibodies, folding processes can be examined in great detail. This system has been used to analyze the folding of proteins with a huge variation in properties such as soluble proteins, single and multi-pass transmembrane proteins, heavily N- and O-glycosylated proteins, and proteins with and without extensive disulfide bonding. Pulse-chase methods are the basis of kinetic studies into a range of additional features, including co- and posttranslational modifications, oligomerization, and polymerization, essentially allowing the analysis of a protein from birth to death. Pulse-chase studies on protein folding are complementary with other biochemical and biophysical methods for studying proteins in vitro by providing increased temporal resolution and physiological information. The methods as described within this paper are adapted easily to study the folding of almost any protein that can be expressed in mammalian or insect-cell systems.

Here we describe a protocol for a general pulse-chase method that allows the kinetic analysis of folding, transport, and degradation of proteins to be followed in live cells.

放射性脉冲追逐对活细胞蛋白质折叠、迁移和降解的分析

Radioactive pulse-chase labeling is a powerful tool for studying the conformational maturation, the transport to their functional cellular location, and ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ubiquitinated proteins, peptides with a diglycine remnant conjugated to the epsilon amino group of lysine (&#39;K-&#949;-diglycine&#39; or simply &#39;diGly&#39;) can be used to track back the original modification site. Efficient immunopurification of diGly peptides combined with sensitive detection by mass spectrometry has resulted in a huge increase in the number of ubiquitination sites identified up to date. We have made several improvements to this workflow, including offline high pH reverse-phase fractionation of peptides prior to the enrichment procedure, and the inclusion of more advanced peptide fragmentation settings in the ion routing multipole. Also, more efficient cleanup of the sample using a filter-based plug in order to retain the antibody beads results in a greater specificity for diGly peptides. These improvements result in the routine detection of more than 23,000 diGly peptides from human cervical cancer cells (HeLa) cell lysates upon proteasome inhibition in the cell. We show the efficacy of this strategy for in-depth analysis of the ubiquitinome profiles of several different cell types and of in vivo samples, such as brain tissue. This study presents an original addition to the toolbox for protein ubiquitination analysis to uncover the deep cellular ubiquitinome.

We present a method for the purification, detection, and identification of diGly peptides that originate from ubiquitinated proteins from complex biological samples. The presented method is reproducible, robust, and outperforms published methods with respect to the level of depth of the ubiquitinome analysis.

通过肽浓缩和质谱检测蛋白质泛化位点检测

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Characterizing Individual Protein Aggregates by Infrared Nanospectroscopy and Atomic Force Microscopy

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with neurodegenerative conditions such as Alzheimer&#8217;s and Parkinson&#8217;s diseases. In particular low molecular weight aggregates, amyloid oligomers, have been shown to possess generic cytotoxic properties and are implicated as neurotoxins in many forms of dementia. We illustrate the use of methods based on atomic force microscopy (AFM) to address the challenging task of characterizing the morphological, structural and chemical properties of these aggregates, which are difficult to study using conventional structural methods or bulk biophysical methods because of their heterogeneity and transient nature. Scanning probe microscopy approaches are now capable of investigating the morphology of amyloid aggregates with sub-nanometer resolution. We show here that infrared (IR) nanospectroscopy (AFM-IR), which simultaneously exploits the high resolution of AFM and the chemical recognition power of IR spectroscopy, can go further and enable the characterization of the structural properties of individual protein aggregates, and thus offer insights into the aggregation mechanisms. Since the approach that we describe can be applied also to the investigations of the interactions of protein assemblies with small molecules and antibodies, it can deliver fundamental information to develop new therapeutic compounds to diagnose or treat neurodegenerative disorders.

We describe the application of infrared nanospectroscopy and high-resolution atomic force microscopy to visualize the process of protein self-assembly into oligomeric aggregates and amyloid fibrils, which is closely associated with the onset and development of a wide range of human neurodegenerative disorders.

通过红外纳米光谱和原子力显微镜对单个蛋白质聚合进行特征化

The phenomenon of protein misfolding and aggregation results in the formation of highly heterogeneous protein aggregates, which are associated with ...

Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the dissection and manipulation of biological pathways. Currently, only a limited number of chemically induced dimerization (CID) systems exist and engineering new ones with desired sensitivity and selectivity for specific small-molecule ligands remains a challenge in the field of protein engineering. We here describe a high throughput screening method, combinatorial binders-enabled selection of CID (COMBINES-CID), for the de novo engineering of CID systems applicable to a large variety of ligands. This method uses the two-step selection of a phage-displayed combinatorial nanobody library to obtain 1) &#34;anchor binders&#34; that first bind to a ligand of interest and then 2) &#34;dimerization binders&#34; that only bind to anchor binder-ligand complexes. To select anchor binders, a combinatorial library of over 109 complementarity-determining region (CDR)-randomized nanobodies is screened with a biotinylated ligand and hits are validated with the unlabeled ligand by bio-layer interferometry (BLI). To obtain dimerization binders, the nanobody library is screened with anchor binder-ligand complexes as targets for positive screening and the unbound anchor binders for negative screening. COMBINES-CID is broadly applicable to select CID binders with other immunoglobulin, non-immunoglobulin, or computationally designed scaffolds to create biosensors for in vitro and in vivo detection of drugs, metabolites, signaling molecules, etc.

Creating chemically induced protein dimerization systems with desired affinity and specificity for any given small molecule ligand would have many biological sensing and actuation applications. Here, we describe an efficient, generalizable method for de novo engineering of chemically induced dimerization systems via the stepwise selection of a phage-displayed combinatorial single-domain antibody library.

通过组合单域抗体库的分步噬菌体选择创建高度特异性化学诱导蛋白分解系统

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the ...

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, and protein-protein interactions. FPOP utilizes a KrF excimer laser at 248 nm for photolysis of hydrogen peroxide to generate hydroxyl radicals which in turn oxidatively modify solvent-accessible amino acid side chains. Recently, we expanded the use of FPOP of in vivo oxidative labeling in Caenorhabditis elegans (C. elegans), entitled IV-FPOP. The transparent nematodes have been used as model systems for many human diseases. Structural studies in C. elegans by IV-FPOP is feasible because of the animal&#8217;s ability to uptake hydrogen peroxide, their transparency to laser irradiation at 248 nm, and the irreversible nature of the modification. The assembly of a microfluidic flow system for IV-FPOP labeling, IV-FPOP parameters, protein extraction, and LC-MS/MS optimized parameters are described herein.

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In vivo fast photochemical oxidation of proteins (IV-FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting technique that allows for mapping of protein structure in their native environment. This protocol describes the assembly and set-up of the IV-FPOP microfluidic flow system.

在Vivo羟基基蛋白足迹研究卡诺哈布迪特人的蛋白质相互作用

Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, ...

用 [NiFe] 氢对 H₂氧化的研究表明, 蛋白质膜红外电化学

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