该方法为蛋白质修饰领域提供了重要的工具，使抗体药物结合物的生成更加简单、高效。该技术的主要优点是操作方便，抗体产生高产，精神不良反应的速度，以及联动形成的稳定性。从文本协议中描述的生长 HEK 悬浮细胞开始此过程。
当达到每毫升250万细胞的密度时，准备在1摩尔氢氧化钠中对莱辛（CpK）的环丙烯衍生物（CpK）进行新的溶液。加入2.5毫升的CpK到表达介质中，辅以抗生素。混合溶液，加入250微升的摩尔HCl，然后使用22微米过滤器对溶液进行消毒。
现在，以目标密度将1.25亿个细胞以500xg的密度离心5分钟。离心后，将脱氧核糖核酸转染试剂混合物加入含有CpK的表达介质中，并使用此培养基重新注入细胞。加入CpK后6至7天，在3000xg下离心15分钟，从上经剂中收获带有CpK抗体的trastuzumab。
然后，过滤上清液。现在，在250毫升锥形管中加入5x珠洗缓冲液，与上清液混合，加入预平衡蛋白 A 树脂。在室温下将锥形管放在滚筒上三小时，以提取抗体和上流液。
孵育后，将蛋白 A 树脂与上清液转移到柱子中，让液体流过。然后加入25毫升的洗涤缓冲液，并允许它流过。将一毫升一摩尔磷酸盐缓冲液、150毫摩尔氯化钠加入收集管，用四毫升1摩尔柠檬酸钠pH 3洗涤抗体。
酸性溶液立即中和，因为它从柱上脱落的基本溶液已经存在于收集管。接下来，用10毫升PBS稀释抗体。通过离心过滤将抗体浓缩到5至1毫升，用PBS将缓冲液交换三次。
使用 FPLC 在高盐缓冲液中用 0 到 100% 的低盐缓冲液梯度进行丁基疏水相互作用柱对样品进行净化。收集所有分数，并在 280 纳米监控洗脱。通过离心过滤浓缩含有抗体的馏分，用PBS将缓冲液交换三次。
然后，抗体可以储存在4摄氏度。单甲基尿素E，或MMAE，是剧毒。因此，在处理 MMAE 衍生物时，请使用手套和护目镜。
如果使用未修改的 MMAE 作为控件，在 MSO 中准备库存溶液时，请处理烟罩内的固体产品。为了将抗体与四苯并酸结轴承分子结合，在一个小锥形管中用20微升的乙酰三硝基和76微升的PBS稀释10个三聚氨酸MMAE的摩尔等效性。添加一个相当于带CPK的trastuzumab摩尔。
彻底混合，允许在室温下反应三小时，形成与MMAE相连的trastuzumab。使用此协议，MMAE 以外的分子可能更大、更受到类固醇阻碍，可与抗体相关。将反应的整个体积添加到旋转柱上，以 1500 x g 离心一分钟。
要分析偶联体，请将 HPLC HIC 柱与 100% 高盐缓冲液平衡五分钟。然后将与MMAE相连的每毫升1毫克溶液的15微升与15微升的2倍高盐缓冲液混合在小瓶中。将混合物注入 HPLC 柱上。
以100%高盐缓冲液每分钟1毫升的等轴流中流淌一分钟。遵循此，在低盐缓冲液中，从 100% 到 0% 的高盐缓冲液的 15 分钟梯度。以 280 纳米的速度监控洗脱。
将色谱图上的峰与保留时间 7.5、9.2 和 11.5 分钟集成，这些峰值分别对应于与零、一和两种结合毒素对应的 trastuzumab。现在，计算 DAR，将峰值区域加起来为 9.2 分钟，该区域的重量为 1，权重为 10.5 分钟，权重为 2，并除以三个峰值的总面积。为了分析LC-MS的偶联，首先，在37摄氏度下使用250个单位PNGase F在非还原条件下，脱胶糖酸酯30微升，每毫升ADC1毫克1毫克，非还原性抗体在非还原条件下至少6小时。
解冻血清，并通过22微米过滤器过滤。然后将96井板的外部水填满。在中央井中，将三升90微升血清与每毫升10微升的四甲苯四甲苯丙胺混合在PBS中，最终浓度为每毫升1毫克。
将板放在湿度为 37 摄氏度和 4% 的 CO2 饱和的培养箱中。每24小时在五天，移液器每个井彻底混合，并采取5微升等分。用液氮将等分液冻结，储存在80摄氏度。
收集所有样本后，解冻等分，并使用间接 ELISA 进行分析，详见文本协议中。或者，商用 ELISA 套件可用于测量ADC的浓度。在测定前两天，将96井板的外井装满水。
然后在5毫摩尔EDTA中抬起05%的三辛细胞。以250xg离心三分钟，并在新介质中重新发送。然后在96个井板中每井100微升中播种3000个细胞，并把它们放回孵化器中。
种子细胞两天后，用1%的DMSO在全介质中准备三分之一中所有样品的连续稀释。现在，每个样品中加入100微升，在37摄氏度和4%的CO2下孵育5天。第五天，测量细胞的生存能力。
为此，使用商业套件对细胞进行细胞精，并测量释放的 ATP。绘制与用 1% DMSO 处理的控制细胞有关的信号百分比。ADC可以在37摄氏度的血清中孵育5天，并检测细胞毒性，以证明功能稳定性。
使用该程序可获得具有环丙烯手柄的抗体，在蛋白质 A 纯化后，其产量高于每升 20 毫克。产生的抗体可以迅速和具体地与含有四聚氨酸的毒素结合。抗体与毒素结合后，通过疏水性相互作用色谱法测量，药物与抗体的平均比率大于1.9。
ADC的特性由质谱法确认。在37摄氏度下，在人体血清中产生的二氢化物键在5天以上保持稳定。抗体药物结合是有效的，选择性地杀死具有高血性 HER2 的细胞，而不是低浓度 HER2 的细胞。
此外，没有毒素的抗体和用四苯氨酸链接剂修饰的毒素具有非常低的毒性。仅毒素就显示了非 HER2 依赖毒性，突出了目标定位以实现选择性方面需要。按照这个程序，我们可以快速有效地准备抗体药物结合治疗肿瘤。
任何可能，任何使用四角素功能化的药物都可以与任何针对癌细胞生物标志物的抗体相关。这种技术的影响延伸到任何用于治疗或诊断的蛋白质结合物。
