在培养的小鼠神经元中可视化轴突生长锥塌陷和早期淀粉样β效应

这种方法可以帮助回答阿尔茨海默病研究领域的关键问题，特别是生长锥体崩溃的早期事件。该技术的主要优点是使得在淀粉样β治疗后立即可视化和分析斧结生长锥体成为可能。首先使用微剪刀从没有抗生素的神经元培养媒介中胚胎-第14天小鼠中切碎新鲜分离的脑皮质。

收集组织，在87G下将组织离心三分钟。离心后，去除上经剂，在颗粒中加入两毫升0.05%的三辛。在37摄氏度下孵育15分钟，每5分钟点击一次混合。

15分钟后，加入四毫升的介质 A 中和尝试，然后按点混合。然后在178次G下将组织离心3分钟。去除上经剂后，加入DNAse和大豆蛋白酶抑制剂溶液，在37摄氏度下孵育15分钟，每五分钟与之前一样混合一次。

当孵育时间过长时，添加四毫升的中等 A.Mix 和离心机。去除上流液后，加入四毫升的介质 A，用抛光的巴斯德移液器对组织进行三角化，直到没有观察到碎屑。接下来，用70微米孔径的网状网过滤三化组织。

过滤后，用血细胞计计算细胞并计算细胞密度。移液 0.8 倍 10 到中 A 中的第四个细胞进入八井培养幻灯片的每个井中。然后在37摄氏度的10%CO2的加湿大气中孵育。

经过四个小时的培养，将培养介质更改为中B。使用这种方法的神经元纯度约为75%，至少提前一周开始这种检测，打开商业获得的全长 A beta 42 的新鲜小瓶，将无菌蒸馏水中的含量溶解到0.5毫摩尔的浓度。在37摄氏度下孵育7天，诱导聚集和毒性。准备聚合 A 1-42 的等分，并在零下 80 摄氏度储存，直到使用。

在神经元培养的第四天，用100微升0.5微摩尔将Β1-42或车辆溶液在中B中溶液中治疗一小时，如先前所证明的。一小时后，取出培养基，立即用含有4%蔗糖的4%甲醛在PBS中固定神经元，在37摄氏度的热盘上加热一小时。固定性是最重要的，因为保持生长锥的形状对于此协议至关重要。

固定后，用PBS清洗神经元三次。然后，在取出腔室后，使用水性安装介质安装神经元。在四摄氏度下干燥安装介质两到四天。

在倒置显微镜上使用 20 倍干式客观透镜捕获每口井的整个区域。捕获和分析每一个井的整个区域对于避免主观性非常重要。在第三阶段或第四阶段将每个神经元最长的中性分类为轴子。

缺乏拉梅利波迪亚或拥有少于三个纤维的斧头生长锥被认为是折叠生长锥体。在孵化前所示的β1-42寡聚物，在37摄氏度的孵育7天后聚集。在聚合的 A beta 1-42 治疗后，使用 A beta 的有毒寡聚物的抗体进行免疫染色后，在 A beta 1-42 治疗的神经元上显示红色阳性染色，而不是车辆处理的神经元。

在培养四天后，对Β1-42治疗引起的早期现象进行了分析。通过对突发标记tau-1的阳性免疫保持，确认了突克的突克，而树突标记的呈阴性免疫着色剂，MAP-2，以绿色显示。经过一个小时的车辆治疗，生长锥体已经蔓延了拉梅利波迪亚和几个纤维。

这些被确定为健康生长锥体。相反，一小时的Β1-42治疗导致生长锥体收缩，这发展没有拉梅利波迪亚或纤维素。这些被确定为折叠生长锥体。

在尝试此过程时，重要的是要记住在 37 摄氏度下用 4%PFA 和 4%蔗糖修复细胞，以最佳方式修复此固定协议。按照此协议，可以执行其他方法，如活细胞成像和基因转染，以回答其他问题，如轴龙生长锥体何时以及如何折叠以及如何恢复折叠生长锥体。