يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال أبحاث مرض الزهايمر ، وخاصة الأحداث المبكرة التي تنطوي عليها انهيار مخروط النمو. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هو جعل من الممكن تصور وتحليل مخاريط النمو المحوري مباشرة بعد علاج بيتا اميلويد. ابدأ باستخدام المقص الصغير ل mince القشريات الدماغية المعزولة حديثًا من الفئران الجنينية day-14 في وسط ثقافة الخلايا العصبية بدون مضادات حيوية.
جمع الأنسجة وأجهزة الطرد المركزي الأنسجة في 87G لمدة ثلاث دقائق. بعد الطرد المركزي، وإزالة عظمى وإضافة ملليلتر اثنين من 0.05٪ التربسين إلى بيليه. احتضان لمدة 15 دقيقة في 37 درجة مئوية ويخلط عن طريق التنصت كل خمس دقائق.
بعد 15 دقيقة، إضافة أربعة ملليلتر من متوسطة A لتحييد التربسين، ومزيج عن طريق التنصت. ثم الطرد المركزي الأنسجة في 178 مرات G لمدة ثلاث دقائق. بعد إزالة supernatant، إضافة DNAse وفول الصويا محلول مثبطات التربسين واحتضان لمدة 15 دقيقة في 37 درجة مئوية مع خلط كل خمس دقائق كما كان من قبل.
عند انقضاء وقت الحضانة، أضف أربعة ملليلترات من A.Mix المتوسطة والطرد المركزي كما كان من قبل. بعد إزالة المابير، إضافة أربعة ملليلترات من متوسط A triturate الأنسجة مع ماصة باستور مصقول حتى يتم رصد أي حطام. بعد ذلك، قم بتصفية الأنسجة ثلاثية الترور مع شبكة بحجم 70 ميكرون من المسام.
بعد الترشيح، عد الخلايا مع قياس الهيموزيت وحساب كثافة الخلية. Pipette 0.8 مرات 10 إلى الخلايا الرابعة في المتوسط A في كل بئر من شريحة ثقافة ثمانية بئر. ثم احتضان في جو مرطب من 10٪ ثاني أكسيد الكربون في 37 درجة مئوية.
بعد أربع ساعات من زراعة, تغيير ثقافة متوسطة إلى متوسطة B.The نقاء الخلايا العصبية باستخدام هذا الأسلوب هو ما يقرب من 75٪ ابدأ هذا الفحص أسبوع على الأقل مقدما من خلال فتح قارورة جديدة من الحاصلة تجاريا كامل طول بيتا 42 وحل محتويات في العقيمة, الماء المقطر إلى تركيز 0.5 millimolar. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة سبعة أيام للحث على التجميع والسمية. إعداد aliquots من المجمعة بيتا 1-42 وتخزينها في ناقص 80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
في اليوم الرابع من ثقافة الخلايا العصبية، وعلاج الآبار مع 100 ميكرولتر من 0.5 micromolar تجميعها بيتا 1-42 أو حل السيارة في B المتوسطة لمدة ساعة واحدة كما هو موضح سابقا. بعد مرور ساعة، وإزالة المتوسطة الثقافة وعلى الفور إصلاح الخلايا العصبية مع 4٪ شبهformaldehyde تحتوي على 4٪ السكروز في برنامج تلفزيوني لمدة ساعة واحدة في 37 درجة مئوية على لوحة ساخنة. التثبيت هو الأكثر أهمية كما الحفاظ على شكل المخاريط النمو أمر بالغ الأهمية لهذا البروتوكول.
بعد التثبيت، وغسل الخلايا العصبية ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني. ثم بعد إزالة الغرفة، جبل الخلايا العصبية مع المتوسطة تصاعد مائي. جفف المتوسط المتصاعد عند أربع درجات مئوية لمدة يومين إلى أربعة أيام.
التقط كامل مساحة كل بئر مع عدسة الهدف الجاف 20X على مجهر مقلوب. التقاط وتحليل المنطقة بأكملها في كل بئر مهم لتجنب الذاتية. تصنيف أطول نيوريتات من كل خلية عصبية في المرحلة الثالثة أو الرابعة كمحور.
تعتبر مخاريط النمو أكسونال تفتقر إلى lamellipodia أو امتلاك أقل من ثلاثة filopodia المخاريط النمو المنهارة. بيتا 1-42 oligomers، هو مبين هنا قبل الحضانة، تجميع بعد سبعة أيام من الحضانة في 37 درجة مئوية. بعد العلاج مع تجميع بيتا 1-42, المناعة مع جسم مضاد ل oligomer السامة من بيتا يظهر تلطيخ إيجابية في الأحمر على الخلايا العصبية بيتا 1-42 المعالجة, ولكن ليس الخلايا العصبية معاملة السيارة.
تم تحليل الظواهر المبكرة الناجمة عن علاج بيتا 1-42 بعد أربعة أيام في الثقافة. تم تأكيد محاور عصبية محددة على هذا النحو عن طريق الكبت المناعي الإيجابي لعلامة محور عصبي تاو-1 مبينة في المناعة الحمراء والسلبية للعلامة التشعبية MAP-2، الموضحة باللون الأخضر. بعد ساعة واحدة من العلاج في السيارة، والمخاريط النمو قد انتشرت lamellipodia والعديد من filopodia.
تم تحديد هذه على أنها مخاريط النمو الصحي. على العكس من ذلك، أدت ساعة واحدة من بيتا 1-42 العلاج إلى تقلص المخاريط النمو، والتي وضعت أي lamellipodia أو filopodia. تم تحديد هذه على أنها مخاريط النمو المنهارة.
أثناء محاولة هذا الإجراء، من المهم أن نتذكر لإصلاح الخلايا مع PFA 4٪ و 4٪ سكروز في 37 درجة مئوية لبلدي ولا-idge هذا البروتوكول التثبيت في أفضل. بعد هذا البروتوكول، يمكن تنفيذ طريقة أخرى مثل التصوير بالخلايا الحية وتنقيل الجينات للإجابة على أسئلة إضافية مثل متى وكيف تنهار مخاريط النمو المحورية وكيف يتم استرداد مخاريط النمو المنهارة.
