이 방법은 알츠하이머 병 연구 분야의 주요 질문, 특히 성장 콘 붕괴와 관련된 초기 사건에 답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 아밀로이드 베타 치료 직후 축축산 성장 콘을 시각화하고 분석할 수 있도록 하는 것입니다. 항생제없이 뉴런 배양 배지에서 배아 일-14 마우스에서 갓 분리 된 대뇌 코르티스를 다진 마이크로 가위를 사용하여 시작합니다.
조직을 수집하고 조직을 원심 분리하여 87G에서 3 분 동안 원심분리하십시오. 원심 분리후, 상체를 제거하고 펠릿에 0.05%의 트립신 2마리를 추가합니다. 섭씨 37도에서 15분간 배양하고 5분간격으로 섞어 섞어드린다.
15분 후, 중간 크기의 A 밀리리터 4개에 추가하여 트립신을 중화시키고 눌러 섞습니다. 그런 다음 조직을 3 분 동안 178 배 G로 원심 분리합니다. 상체를 제거한 후 DNAse 및 대두 트립신 억제제 용액을 넣고 섭씨 37도에서 15분 동안 배양하고 이전과 같이 5분마다 혼합합니다.
잠복기 시간이 경과하면, 이전과 같이 중간 A.Mix 및 원심 분리기의 4 밀리리터를 추가합니다. 상체를 제거한 후 중간 크기의 4밀리리터를 추가하고 이물질이 관찰되지 않을 때까지 연마된 파스퇴르 파이펫으로 조직을 세리세게 합니다. 다음으로, 70미크론 모공 크기의 메쉬로 삼중 조직을 필터링합니다.
여과 후, 혈전계로 세포를 계산하고 세포 밀도를 계산합니다. 파이펫은 중간 크기의 A의 네 번째 세포에 0.8배 10배씩 각각의 우물로 8웰 배양 슬라이드를 한다. 그런 다음 섭씨 37도에서 10 % CO2의 가습 된 분위기에서 배양하십시오.
배양 4시간 후, 배양 배지를 중간B.이 방법을 이용한 뉴런의 순도는 약 75%이며, 상업적으로 수득된 전길이 의 신선한 유리병을 열고 멸균, 증류수의 농도0.5밀리알라의 농도로 용해시킴으로써 적어도 일주일 전에 이 분석법을 시작한다. 집계 및 독성을 유도하기 위해 7 일 동안 섭씨 37도에서 배양하십시오. 집계된 A 베타 1-42의 알리쿼트를 준비하고 사용 전까지 영하 80도에 보관하십시오.
뉴런 배양의 4일째에, 이전에 입증된 바와 같이 1시간 동안 중간 B에서 베타 1-42 또는 차량 용액을 집계한 0.5 마이크로리터 100마이크로리터로 우물을 치료한다. 시간이 경과 한 후, 배양 배지를 제거하고 즉시 뜨거운 접시에 섭씨 37도에서 1 시간 동안 PBS에서 4 %의 자당을 포함하는 4 %의 para포름 알데히드로 뉴런을 수정합니다. 이 프로토콜에서 성장 원수의 모양을 유지하는 것이 가장 중요하기 때문에 고정은 가장 중요합니다.
고정 후 PBS로 뉴런을 세 번 씻으시면 됩니다. 그런 다음 챔버를 제거 한 후 수성 장착 매체로 뉴런을 장착하십시오. 2~4일 동안 섭씨 4도에서 마운팅 배지를 건조시다.
반전 된 현미경에 20X 건조 객관적인 렌즈와 각 우물의 전체 영역을 캡처합니다. 각 우물의 전체 영역을 캡처하고 분석하는 것은 주관성을 피하는 데 중요합니다. 3~4단계에서 각 뉴런의 가장 긴 중성염을 축삭으로 분류한다.
축 사 성장 콘 라멜리포디아 부족 또는 3 개 미만의 filopodia를 소유 하는 붕괴 성장 콘으로 간주 됩니다. 잠복기 전에 여기에 표시된 베타 1-42 올리고머는 섭씨 37도에서 7 일간의 배양 후 집계합니다. 베타 1-42를 집계한 후, 베타의 독성 올리고머에 대한 항체와의 면역염색은 베타 1-42 처리된 뉴런에 빨간색으로 양성 염색을 나타내지만, 차량 처리뉴런은 아니다.
베타 1-42 치료에 의해 유도된 초기 현상은 배양에서 4일 후에 분석되었다. 확인된 축축은 축산 마커 타우-1에 대한 양성 면역스테인팅에 의해 확인되었으며, 수지상 마커에 대한 적색 및 음수 면역스테인링으로 도시된 MAP-2, 그린으로 도시되었다. 차량 치료의 한 시간 후, 성장 콘은 라멜레포디아와 여러 filopodia 확산했다.
이들은 건강한 성장 원자로 확인되었습니다. 반대로, 베타 1-42 치료의 한 시간은 라멜리포디아 또는 filopodia를 개발하지 않는 수축 성장 콘으로 이어졌다. 이들은 붕괴 된 성장 콘으로 확인되었다.
이 절차를 시도하는 동안, 그것은 내 -nor-idge이 고정 프로토콜에 섭씨 37도에서 4 %의 PFA와 4 %의 자당으로 세포를 고치는 것을 기억하는 것이 중요합니다. 이 프로토콜에 따라, 살아있는 세포 화상 진찰 및 유전자 이식 같이 그밖 방법은 축축한 성장 콘이 붕괴되는 때 그리고 어떻게 붕괴된 성장 콘이 복구되는지 와 같은 추가 질문에 대답하기 위하여 수행될 수 있습니다.
