这种方法可以帮助回答进化生物学中的关键问题，如社会交流的进化。这种技术的主要优点是，它为哑剧肌肉的形式和存在提供了直接的证据。它消除了解剖过程中的猜测，并保留了肌肉层。
与D DiceCT相结合，反向解剖是哑肌调查的新黄金标准。首先，请按照随附的文本协议进行标本固定和准备。然后，将试样转移到烟罩。
然后，在自来水中冲洗试样数小时。样品冲洗后，用纸巾拍干，然后转移到工作站。随着大脑和覆盖的钙质切除，在头骨的格拉贝拉区域附近做一个切口，另一个切口沿着头骨的骨骼方面，在那里颅骨完好无损。
在头骨的骨边为外部腹体突出。这标志着头骨与脊柱相遇的区域。然后使用手术刀，做一个中线切口，从外部腹体突出开始。
将标本在头骨的前部和正面区域上进行玫瑰花切。继续并通过轨道区域之间的眼睛，下鼻区，一路通过外部鼻区之间的鼻。接下来，在下部和中央切口之间的下部切口上做一个切口，然后将手术刀切向锁骨。
此时，选择面罩的一侧，然后从头骨中释放出来，将另一侧留在位。从腹膜区域开始，使用手术刀切割面罩，包括哑膜肌肉，远离头骨的腹骨，用玫瑰色和横向拉面的面膜。切开头骨的肌肉，在头骨上留下少量的肌肉，这样一旦面罩被移除，其附着仍然可以可视化。
通过将部分肌肉留在骨质和骨质的头骨上，附件可以保存下来，并在以后记录下来。一旦外耳被击中，定位耳部肌肉。切开这些肌肉，使每个肌肉的一小部分留在头骨。
然后，切开弹性软骨，将外耳连接到头骨。继续拉面膜，从头骨中释放每个哑膜肌肉，将每个肌肉的一小部分留在头骨上。一旦头骨的一侧有一个完好无损的面罩，允许它坐在暴露在空气中的肌肉，一到三个小时，这取决于标本的大小。
这将干燥面罩上的结缔组织，并增加肌肉和结缔组织之间的颜色对比度。随着肌肉和结缔组织之间的对比现在增强，使用数字三手术刀，钳子和微型剪刀去除足够的结缔组织，以可视化肌肉。在这个反向解剖中，模仿肌肉的肤浅层，轻轻地抬起和分离到表面层的深层肌肉，并去除表面肌肉周围的结缔组织。
完成后，将生成的面罩放回正式。程序可以暂停在这里，然后再进入进一步解剖，或继续染色之前。在每个中间步骤，让面部面罩有足够的干燥时间，使结缔组织可以很容易地从肌肉组织辨别。
为了使哑剧肌肉使用CT扫描可视化，使用碘溶液将面罩放入Lugol的染色溶液中，如随附的文本协议所述，对面罩进行染色。染色过程通常需要大约两个星期，在1.75%Lugol的解决方案。但是，此时间因几个因素而异。
建议间歇性扫描，并伴有染色调整。对于 CT 扫描，首先使用木制牙签将面罩安装到低密度材料（如花卉泡沫）上，准备面罩。这将消除面膜中的任何皱纹，并限制其运动，因为它在扫描过程中稍微干燥。
接下来，将试样放在低密度容器中，并固定到位。安全后，将试样放入扫描仪中，关闭车门，然后打开 X 光片。然后，为高分辨率 X 射线计算机断层扫描设置 CT 扫描参数。
使用这些扫描的切片间间距和像素间距离约为 0.05 毫米，因为小分册会以较低的分辨率被遮盖。如果分膜无法完全可视化，由于过度染色，将面罩放入脱污溶液中，如 10%甲醛或 5%硫化钠，以去除一些污渍。调整染色后，再次扫描面罩，并继续进行必要的调整，直到所有分册都能够完全可视化。
通过使用反向解剖创建面部掩膜，有时可以看到比传统的解剖方法更充分地表示哑剧肌肉。这种方法适用于各种体型，从马莫塞特的微小身体，到大体灵长类动物，如黑猩猩。在具有面部肌肉的小体灵长类动物中，一些面部肌肉可能与周围的结缔组织无法区分，并且可能在解剖过程中丢失。
碘渍，如Lugol的，可以改善对比度，帮助解决个别哑剧肌肉，以及个别肌肉分册，并首次获得这些肌肉的整个肌肉体积。如图所示，与外耳相关的一些非常小的肌肉在 DiceCT 扫描中清晰可见。在一些反向解剖过程中，这些肌肉被遗漏并不罕见，这也许是由于它们体积小。
这种三维体积渲染允许基本体积阈值和颜色映射，比单独交叉检查更容易地可视化肌肉。在这里你可以看到，单个肌肉分膜在横截面清晰可见，使数字解剖可行。在尝试此过程时，重要的是要记住，您应该缓慢、谨慎地移动，并经过深思熟虑，因为这种方法具有破坏性。
按照此过程，其他方法（如组织学处理）可用于回答其他问题，如纤维直径或米奥辛纤维类型。该技术开发后，为进化生物学领域的研究人员探索非人类哺乳动物和人类面部表情和视觉交流的演变铺平了道路。别忘了，使用正式手术和装有的手术刀可能非常危险。
执行此过程时，应采取预防措施，例如冲洗标本，以及知道手术刀在什么地方。
