一种微琼脂盐桥电极分析重组膜蛋白质子周转率

这种方法有助于研究膜蛋白，如运输器和通道。关于基板周转率损失的信息比较蛋白质活性和特异性以及不同的生理和病理条件。该技术的主要优点是，它最大限度地减少了潜在的移位变化和无氯化物缓冲条件。

由于更精确的膜电位测量，显著提高了周转率测定的精度。收集拳头步骤的元素。其中包括两个微型毛细管移液器尖端，一个锋利的刀片和一个滑动卡钳。

对于电极有银线，砂纸和三摩尔氯化钾溶液在手。此外，还有乙醇和水用于清洁和直流电源。继续使用两个微移液器尖端。

从包含缓冲区的提示开始。将第二个尖端放在第一个尖端旁边。移动第二个尖端，因此，插入其窄部分时，将至少向第一个尖端的狭窄部分延伸至少 5 毫米。

标记将附加第一个包含尖端的缓冲区的位置。然后使用卡钳测量微加盐桥电极的长度。使用刀片将尖端切割到适当的长度。

用乙醇和水清洁切割表面。接下来，为电极获取大约 8 厘米的银线长度。用乙醇清洗湿巾上的电线，然后用水。

清洁后，使用砂纸在一端平滑一厘米长的表面。此导线具有平滑端，可以进行电化学涂层。将平滑端放入氯化钾溶液中，另一端连接到直流电源进行涂层。

涂覆时，断开电极并用水清洁。干燥后，确定长度，允许它尽可能深入地穿透微毛细管尖端。将电极从未涂覆的一侧切割到适当的长度。

现在，继续用加糖准备盐溶液。在含有水的烧瓶中溶解氯化钾，并使用磁搅拌器帮助混合。取出搅拌器后，在烧瓶中加入阿加罗斯。

将烧瓶加热到微波炉中，在100摄氏度左右融化糖。把它拿出来，目视检查阿加罗斯是否完全溶解。一旦气糖溶解移液器10微升缓慢进入微毛细管，以避免气泡。

将加糖盐溶液小心地移液到微毛细管尖端非常重要，尤其是在高加糖浓度时。如果处理不当，很容易在尖端产生气泡并阻塞电流。从移液器上拆下尖端后，将电极推入移液器中。

确保电极穿透盐溶液。当电极处于室温时，将其插入参考电极到放大器中。支持参考电极，以便使用一毫升缓冲液将其降低到塑料容器中。

接下来，将盐桥电极浸入溶液中。施加电压，并在继续之前检查是否有电流响应。如果测试成功，断开电极。

如有必要，将盐桥电极浸入三摩尔氯化钾溶液中。接下来，准备包含塑料尖端的缓冲液。拿一个微型毛细管尖端，从狭窄的部分识别一个两厘米的点。

在此位置使用加热线将管弯曲 90 度。用锋利的刀子从弯曲的管子上切开五毫米。用乙醇和水清洁被切割的区域。

在继续操作之前，使用带刻度光显微镜测量尖端孔的直径。接下来，将移液器移液器移液器移液三微升溶剂进入和出尖端。

接下来，用三微升缓冲液填充测量尖端。现在，从氯化钾溶液中取回盐桥。将带缓冲液的测量尖端插入盐桥电极上。

将盐桥电极和参考电极连接到放大器。此时，将盐桥电极与参考电极悬浮在缓冲液中。此原理图中表示实验的配置。

在实验中，膜将形成在含有移液器的缓冲器的末端。收集数据以查找膜容量。通过施加三角交流电压信号来创建矩形交流电响应来做到这一点。

接下来，查找零电流下电导和电压。自动应用负 50 到 50 毫伏的电压斜坡，并记录电流。将线性函数拟合到数据中。

斜率是电导，x截距是零电流的电压。完成时，从盐桥上拆下测量尖端。用缓冲液填充新的测量尖端，调整到不同的 pH 值，以在膜上设置质子梯度。

使用新的测量尖端和电极重新建立实验装置，以便重复测量。以下是存在 pH 梯度的代表性电流电压记录。并且，在没有pH梯度的情况下。

线条表示与数据的线性拟合。不同 pH 值的 x 轴交点的变化由 Nernst 方程预测。这些数据表示标准氯化银电极（白色）和黑色微加盐桥电极的膜电位在时间上的变化。

在300秒内，最大班次小于5毫伏，而加糖盐桥电极更稳定。在此图中，作为 pH 梯度的函数的潜在变化，当 pH 梯度增加时，两个电极的行为明显不同。可以找到和比较两种电极类型的质子周转率。

以下是与标准电极相比，盐桥电极测量的线粒体脱钩蛋白一个 UCP1 的质子周转数。也有类似准备的 UCP3 的数据。与阿加盐桥电极的速率似乎更精确。

在尝试此过程时，必须记住确保电极穿透加糖盐溶液。盐桥还必须浸入缓冲液中。最后，确保加糖盐溶液不含气泡。