この方法は、トランスポーターやチャネルなどの膜タンパク質の調査に役立ちます。タンパク質活性と特異性と異なる生理学的および病理学的条件を比較した基質回転率損失に関する情報。この技術の主な利点は、潜在的なシフト変動および塩化物フリーバッファー条件を最小限に抑える点である。
そしてより精密な膜電位測定による回転率決定の精度を著しく高める。拳のステップのための要素を収集します。これらには、2つのマイクロキャピラリーピペットチップ、鋭い刃および滑走キャリパーが含まれる。
電極には銀線、サンドペーパー、3つの塩化カリウム溶液を手元に持っています。また、洗浄用のエタノールと水とDC電源を備えています。2つのマイクロピペットのヒントを使用して作業を進めます。
バッファーを含むヒントから始めます。2 番目の先端を 1 つ目の先端の横に置きます。2番目の先端を移動し、挿入すると狭い部分が少なくとも5ミリメートル延長され、最初の先端の狭い部分に伸びるようにします。
先端を含む最初のバッファが接続される位置をマークします。次にキャリパーを使用して、マイクロ寒天塩ブリッジ電極の長さを測定します。ブレードを使用して、適切な長さに先端を切ります。
カット面をエタノールで洗浄し、水を加えます。次に、電極用の銀線の約8センチメートルの長さを取得します。ワイプのワイヤーをエタノールで洗浄し、水を入れます。
クリーニング後、砂紙を使用して、一方の端で1センチメートルの長さで表面を滑らかにします。平滑化された端が付いているこのワイヤーは電気化学的に塗られる準備ができている。平滑化された端を塩化カリウム溶液に入れ、もう一方の端をDC電源に接続してコーティングします。
コーティングしたら、電極を取り外し、水で洗浄します。乾燥後、マイクロキャピラリー先端をできるだけ深く貫通できる長さを決定します。未塗装側から適切な長さに電極を切ります。
さて、アガロースと塩溶液を準備するために移動します。水を含むフラスコで塩化カリウムを溶解し、混合を助けるために磁気攪拌機を使用しています。攪拌機を取り除いた後、フラスコにアガロースを加えます。
フラスコを電子レンジに持ち込み、熱してアガロースを摂氏約100度で溶かします。アガロースが完全に溶解していることを視覚的に確認するためにそれを取り出します。アガロースが10マイクロリットルのピペットをゆっくりとマイクロキャピラリーに溶解して気泡を避ける。
特に高寒天濃度では、寒天塩溶液を細毛管先端に慎重にピペットすることが重要です。適切に行われていない場合、気泡は容易に先端とブロックの電気流れで生成されます。ピペットから先端を取り外した後、電極を押し込む。
電極が塩溶液に浸透していることを確認します。電極が室温のときに、リファレンス電極をアンプに差し込みます。参照電極を支持して、1ミリリットルのバッファーを持つプラスチック容器に下げることができるようにします。
次に、塩ブリッジ電極を溶液に浸します。電圧を適用し、続行する前に電流応答があることを確認します。テストが成功した場合は、電極を取り外します。
必要に応じて、塩ブリッジ電極を3モル塩化カリウム溶液に浸漬して保管します。次に、プラスチックチップを含むバッファーを準備します。マイクロキャピラリーチップを取り、狭い部分から2センチメートルの点を特定します。
この位置でチューブを 90 度曲げるには、加熱ワイヤを使用します。鋭利なナイフで、曲がったからチューブを5ミリメートルカットします。エタノールで切った部分を水で洗います。
先に進む前に、スケールを持つ軽い顕微鏡を使用して、先端の穴の直径を測定してください。次に、ピペットを溶媒の容器と別のバッファーの近くに移動します。チップに入り出す溶媒のピペット3マイクロリットル。
次に、測定チップに3マイクロリットルのバッファーを充填します。次に、塩化カリウム溶液から塩の橋を取り出します。測定チップをバッファーに接続して、塩ブリッジ電極に差し込みます。
塩ブリッジ電極とリファレンス電極をアンプに接続します。この時点で、塩ブリッジ電極を参照電極で緩衝液中に吊り下げたい。実験の構成の表現は、この回路図にあります。
実験中、膜はピペットを含むバッファーの最後に形成されます。膜の容量を見つけるためにデータを収集します。これは、三角形の交流電圧信号を適用して、矩形の交流応答を作成することによって行います。
次に、ゼロ電流でのコンダクタンスと電圧を見つけます。マイナス50~50ミリボルトの電圧ランプの適用を自動化し、電流を記録します。線形関数をデータに適合します。
傾きはコンダクタンス、x切片はゼロ電流の電圧です。完了したら、塩のブリッジから測定先端を取り除きます。バッファーで新しい測定チップを塗りつぶし、異なる pH 値に調整して、膜全体にプロトン勾配を設定します。
測定を繰り返すために新しい測定先端と電極を用いて設定した実験を再確立する。pH勾配の存在下での代表的な電流記録を次に示します。そして、pH勾配がない場合。
線はデータに線形フィットを表します。異なるpH値のX軸交点のシフトはNernst方程式によって予測されます。これらのデータは、白色の標準的な塩化銀電極に時間の膜電位のシフトを表し、マイクロ寒天塩橋電極を黒色で表している。
寒天塩橋電極は、測定の300秒にわたって5ミリボルト未満の最大シフトでより安定していた。pH勾配の関数としての電位シフトのこのプロットでは、2つの電極はpH勾配が大きくなるにつれて著しく異なる振る舞いが見られる。プロトン回転率は、2つの電極タイプについて見つけ、比較することができます。
ここでは、標準的な電極と比較して塩ブリッジ電極によって測定された1つのUCP1をミトコンドリア非結合タンパク質について決定されるプロトンのターンオーバー数である。同様に準備された UCP3 のデータもあります。料金は寒天塩橋電極でより正確に見えます。
この手順を試みている間、電極が寒天塩溶液に浸透することを確認することを忘れないでください。塩の橋はまた緩衝液に浸す必要があります。最後に、寒天塩溶液に気泡が含まれていることを確認します。
