Este método pode ajudar na investigação de proteínas de membrana, como transportadores e canais. As informações sobre a perda da taxa de rotatividade do substrato comparando atividade e especificidade da proteína e as diferentes condições fisiológicas e patológicas. A principal vantagem dessa técnica é que ela minimiza as possíveis variações de mudança e condições de tampão livre de cloreto.
E aumenta significativamente a precisão da determinação da taxa de rotatividade devido a medidas mais exatas de potencial de membrana. Reúna os elementos para os passos do punho. Estes incluem duas pontas de pipeta micro-capilar, uma lâmina afiada e uma pinça deslizante.
Para o eletrodo tem fio de prata, papel de areia e uma solução de cloreto de potássio molar à mão. Além disso, tem etanol e água para limpeza e um fornecimento de energia DC. Prossiga trabalhando com as duas dicas de micro-pipeta.
Comece com a ponta que conterá o tampão. Coloque a segunda ponta ao lado da primeira. Mova a segunda ponta, por isso, quando inserida sua parte estreita estenderá pelo menos cinco milímetros na parte estreita da primeira.
Marque a posição onde o primeiro tampão contendo ponta será anexado. Em seguida, use a pinça para medir o comprimento do eletrodo da ponte de sal micro-ágar. Use a lâmina para cortar a ponta ao comprimento apropriado.
Limpe a superfície cortada com etanol seguido de água. Em seguida, obtenha um comprimento de aproximadamente oito centímetros de fio de prata para o eletrodo. Limpe o fio em lenços umedecidos com etanol seguido de água.
Após a limpeza, use papel de areia para suavizar a superfície em um centímetro de comprimento em uma extremidade. Este fio com sua extremidade suavizada está pronto para ser revestido eletroquímico. Coloque a extremidade suavizada na solução de cloreto de potássio com a outra extremidade conectada a uma fonte de alimentação DC para revestimento.
Quando for revestido, desconecte o eletrodo e limpe-o com água. Depois de secá-lo, determine o comprimento que lhe permite penetrar a ponta micro capilar o mais profundamente possível. Corte o eletrodo do lado não revestido até o comprimento apropriado.
Agora, vá preparar uma solução de sal com agarose. Em um frasco contendo água dissolver cloreto de potássio e usar um agitador magnético para ajudar na mistura. Depois de remover o agitador adicione agarose ao frasco.
Leve o frasco para um micro-ondas e aqueça-o para derreter a agarose a cerca de 100 graus Celsius. Leve-o para verificar visualmente se a agarose está completamente dissolvida. Uma vez que a agarose é dissolvida pipeta 10 microliters no micro-capilar lentamente para evitar bolhas de ar.
É importante canalizar cuidadosamente a solução de sal de ágar na ponta micro capilar, especialmente em altas concentrações de ágar. Se não forem feitas corretamente, as bolhas de ar são facilmente produzidas na ponta e bloqueiam o fluxo elétrico. Depois de remover a ponta da pipeta empurre o eletrodo para dentro.
Certifique-se de que o eletrodo penetra na solução de sal. Quando o eletrodo estiver à temperatura ambiente, conecte-o em um eletrodo de referência em um amplificador. Suporte o eletrodo de referência para que possa ser abaixado em um recipiente plástico com um mililitro de tampão.
Em seguida, mergulhe o eletrodo da ponte salgada na solução. Aplique uma tensão e verifique se há uma resposta atual antes de continuar. Se o teste for bem sucedido, desconecte os eletrodos.
Se necessário, armazene o eletrodo da ponte salgada mergulhando-o em uma solução de cloreto de potássio de três molares. Em seguida, prepare o tampão contendo ponta plástica. Pegue uma ponta micro capilar e identifique um ponto de dois centímetros da parte estreita.
Use um fio de aquecimento para dobrar o tubo 90 graus nesta posição. Com uma faca afiada corte o tubo a cinco milímetros do dobrado. Limpe a área que foi cortada com etanol seguido de água.
Antes de prosseguir, use um microscópio leve com uma balança para medir o diâmetro do orifício na ponta. Em seguida, mova a pipeta para estar perto de um recipiente de solvente e outro de tampão. Pipeta três microliters do solvente dentro e fora da ponta.
Em seguida, encha a ponta de medição com três microliters de tampão. Agora, recupere a ponte de sal da solução de cloreto de potássio. Conecte a ponta de medição com o tampão no eletrodo da ponte salgada.
Conecte o eletrodo da ponte salgada e o eletrodo de referência a um amplificador. Neste ponto, suspenda o eletrodo da ponte salgada na solução tampão com o eletrodo de referência. Uma representação da configuração para o experimento está neste esquema.
Durante o experimento, a membrana se formará no final do tampão contendo pipeta. Colete dados para encontrar a capacidade da membrana. Faça isso aplicando um sinal de tensão alternada triangular para criar uma resposta de corrente alternada retangular.
Em seguida, encontre a condução e a tensão em corrente zero. Automatize a aplicação de uma rampa de tensão que varia de menos 50 a 50 milvolts e regise a corrente. Encaixe uma função linear nos dados.
A inclinação é a condução, o x-interceptação é a tensão em corrente zero. Quando estiver pronto, retire a ponta de medição da ponte de sal. Encha uma nova ponta de medição com tampão, ajuste-a a diferentes valores de pH para configurar um gradiente de prótons através da membrana.
Restabelece o conjunto experimental com a nova ponta de medição e eletrodos para repetir as medições. Aqui estão gravações de tensão de corrente representativas na presença de um gradiente de pH. E, na ausência de um gradiente de pH.
As linhas representam um ajuste linear aos dados. A mudança no ponto de intersecção do eixo x para os diferentes valores de pH é prevista pela equação de Nernst. Esses dados representam a mudança no potencial da membrana a tempo de um eletrodo padrão de cloreto de prata em branco, e o eletrodo de ponte de sal microágar em preto.
O eletrodo da ponte salgada de ágar foi mais estável com uma mudança máxima de menos de cinco milivolts ao longo de 300 segundos de medição. Nesta parcela da mudança potencial em função do gradiente de pH, os dois eletrodos são vistos se comportando significativamente diferente à medida que o gradiente de pH aumenta. A taxa de rotatividade de prótons pode ser encontrada e comparada para os dois tipos de eletrodos.
Aqui estão os números de rotatividade de prótons determinados para a proteína de desacoplamento mitocondrial um UCP1 medido pelo eletrodo da ponte salgada em comparação com um eletrodo padrão. Há também dados para UCP3 igualmente preparado. As taxas parecem mais precisas com o eletrodo da ponte de sal ágar.
Ao tentar este procedimento é importante lembrar para garantir que o eletrodo penetre na solução de sal ágar. A ponte de sal também deve mergulhar na solução tampão. Por fim, certifique-se de que a solução de sal de ágar não contém bolhas de ar.
