一种研究受体配体相互作用的 bw 报告系统

Shalom.BW 报告器系统能够研究受体配体相互作用。在特定受体的配体未知的情况下，或在内源配体实验在技术上困难的情况下，它非常有用。这种方法是敏感和特定于单个受体，易于操作和重复。

演示程序将是希拉卡隆，我的实验室博士后。转染前一天，10个板与10毫升10万BW5147细胞，并补充RPMI。然后将100微克的PCDNA3质粒放在管子中。

在pH 5.3下加入醋酸钠到管子中。在此之后，在质粒混合物中加入2.5卷100%乙醇。然后在零下20摄氏度下孵育质粒混合物过夜。

电镀BW细胞24小时后，将细胞收集在两个50毫升的管子中。然后在515g的离心5分钟，并丢弃上一代。在不添加任何添加的情况下重新发送 peloton RPMI 并重复离心。

将产生的颗粒重新用 1 毫升的 RPMI 中重新暂停，无需添加。将重新暂停的颗粒转移到冰上 4 厘米的冰块中。离心接受乙醇沉淀的质粒。

然后用一毫升70%乙醇清洗质粒。再重复离心20分钟取出所有乙醇，让颗粒部分干燥。

然后将颗粒重新在 100 微升预热 RPMI 中，无需添加。在此之后，将重新暂停的质粒添加到细胞中。在冰上孵化细胞五分钟。

接下来，电分电池。然后将电分电池转移到50毫升管中。在管中加入50毫升完整介质，在515克的离心机中加热5分钟。

丢弃上一个重物，在50毫升的完整介质中重新暂停细胞。然后在24井培养皿中盘制细胞，并孵育细胞48小时。在此之后，添加一毫升的完整介质，每毫升G41810补充10毫克到每一个井。

48小时后，丢弃每井上部一毫升的上体积。然后添加一毫升完整的介质，每毫升G418补充5毫克到每一个井。在96井板的单一井中，使用5万个转染BW细胞及其所需的靶点。

孵育板48小时。然后在零下20摄氏度时将盘子冻结。涂上具有抗小鼠IL-2抗体的ELISA板。

将05微克的防鼠IL-2，在每井中放置50微升PBS。在摄氏四度下孵育涂层板过夜。使用37摄氏度的短暂孵育期，解冻以前用目标孵育的冷冻BW细胞。

然后将板离心，将 100 微升的上一液从每个井转移到预涂层的 ELISA 板。并在37摄氏度下孵育两小时。在此之后，将生物素抗小鼠IL-2添加到ELISA板中。

然后孵育和洗涤后，将HRP结合的链球菌素加入到盘子中。孵育和洗涤后，在ELISA板的每个井中加入100微升的TMB基板溶液。最后读取 650 纳米的 ELISA 板。

在此示例中，CLL 细胞用不同的抗 CD20 抗体进行预孵化。然后与表达Fc受体CD16的转染BW细胞共同孵育，然后用ELISA进行分析。使用 ELISA 分析后，结果进行了量化。

光学密度水平，根据标准曲线转换为小鼠IL-2浓度。在另外一项实验中，不同剂量的抗CD20抗体与CLL细胞进行预孵化。然后用转染的BW细胞孵育。

该粒子包含四个主要部分。BW 细胞的克隆、转染、活化和 ELISA。每个部件都应独立验证。

按照这个程序，可以对表达内源受体的细胞进行额外的实验，例如用NK细胞杀死酸，以研究与NK细胞受体的相互作用。我们利用这个系统发现了NK细胞受体的新配体。例如，下凝蛋白是 NKp46 的配体，PVL 是 TG 的配体。