此方法解决了该领域的常见问题，并为具有特定兴趣标记的单细胞外囊泡的快速隔离和表征提供了完整的工作流程。纳米粒子跟踪分析是一种半自动化的方法。它利用光散射和布朗运动的属性来分析细胞外囊泡的大小分布。
演示这个程序的将是维拉·施密特，一个来自我们实验室的博士生。为了分离细胞外囊泡，在将两毫升的人体全血样本收集到血清分离管中后，让样本在室温下凝固15分钟，然后通过离心将细胞从血清中分离。将每个样品中的一毫升血清转移到单独的1.5毫升反应管中，用于离心去除血小板，并转移100微升血小板贫素血浆到新的1.5毫升反应管。
接下来，在等离子体中加入25微升的外体沉淀溶液，彻底涡流样品。在冰上孵育30分钟后，通过离心收集细胞外囊泡。颗粒将显示为米色或白色。
吸上一液并再次离心样品。然后，去除所有液体的恍然大悟，将颗粒重新在 100 微升 PBS 中。要染色囊泡的细胞膜，在50微升新鲜准备的PKH67乙醇染料溶液中加入10微升的EV悬浮液，并彻底混合。
在黑暗中室温下5分钟后，用2.5毫升蒸馏水在15毫升锥形管中稀释50微升染色的细胞外囊泡悬浮液，并进行彻底混合。要用抗体标记囊泡，在1.5毫升反应管中用50微升蒸馏水稀释10至20微升未污染的细胞外囊泡悬浮液，并进行彻底混合。将2.5至5微升的抗体加入反应管，彻底混合，在黑暗中室温下孵育30分钟。
然后，将50微升的标记囊泡转移到一个15毫升的圆锥管中，该管含有适当的蒸馏水的实验体积，并彻底混合，如表中所示。在分析染色或标记的细胞外囊泡之前，首先将荧光过滤器移动到显微镜和相机的光学路径中，然后按照屏幕上的说明启动程序，实现自动实施。在"细胞检查"选项卡下，选择用于荧光测量的正确细胞号和光学器件的参考位置，以确认激光和显微镜是否处于共同焦点。
使用注射器用 10 毫升蒸馏水冲洗细胞通道，注意测量单元没有气泡，并且不会将气泡注入系统。接下来，在990微升蒸馏水中稀释10微升200纳米大小的荧光标记聚苯乙烯颗粒，并将10微升的颗粒悬浮液加入含有10毫升蒸馏水的15毫升管中。然后，将第一个稀释颗粒溶液的 2.5 毫升注入细胞通道，然后单击"优化焦点"以调整摄像机。
要测量样品，用10毫升蒸馏水多次冲洗细胞通道，并注射染色的细胞外囊泡悬浮液。使用参考位置，调整"单元格检查"选项卡下的适当采集参数，如表中所示。要确定最佳灵敏度范围，请单击"粒子数与"
灵敏度，用于显示每个屏幕测量的粒子的曲线，以表示不同的灵敏度级别。对于快门参数，调整相机允许光线在确定的时间间隔内通过的时间段。对于后置参数，选择最小亮度为 20，最小尺寸为 20 纳米，最大测量尺寸为 500 纳米。
请注意显示视野中检测到的粒子数。散射条应为绿色到橙色，50 到 300 粒子范围。单击"零伏特"时的粒子漂移，然后打开"测量"选项卡。
单击"运行视频获取"，将实验数设置为 3 到 5，将实验之间的时间延迟设置为零分钟。将单个子卷位置数设置为 11，在分析粒子的每个测量位置将测量周期数设置为 10。然后，选择一个文件夹，创建新的文件名，然后单击"确定"以开始测量。
在分析结束时，打开"分析"选项卡查看结果。然后，检查每个位置的平均粒子数、跟踪粒子总数和粒子浓度、粒子的分布宽度、平均值的值以及标准偏差。使用荧光珠调整和校准测量可提供 85% 的最佳设置灵敏度使用这些设置，摄像机可显示清晰的图像，并且重复测量显示低标准偏差。
使用包括荧光细胞链接器的荧光细胞链接器染色，该试剂盒将绿色荧光染料与长而脂肪的尾部结合到细胞膜的脂质区域，揭示了灵敏度与所测颗粒数量之间的强烈相关性。细胞外囊泡染色抗体对感兴趣的蛋白质表示粒子分布从220到1，145纳米，峰值最大大小为541纳米。在控制性囊泡水的抗体染色后，未检测到细胞外囊泡，如果当漂移大于 5 微米/秒时开始测量，则个别重复表明明显的偏差。
需要注意的是，使用氟素异异氰酸酯作为氟色素会导致不准确和不可重复的测量，因为这种荧光素容易产生快速光漂白。该协议解决了该领域的许多研究人员对使用特定标记快速表征单个细胞外囊泡的主要需求。尽管在过去十年中，方法有了很大改进，但还没有用于分析单个细胞外囊泡的标准化方案。
无论将来细胞外囊泡生物学的研究进展如何，该方法都提供了一种快速可靠的方案，用于使用特定标记物对单个细胞外囊泡进行表征。由于我们当前的协议不涉及长处理时间或劳动密集型步骤，因此它们也适用于高样本吞吐量。
