NTA 结果非常容易出现操作员偏差。此协议演示了更改 NTA 参数对已获得的结果的影响。标准化方法将有助于提高 NTA 分析的严谨性和可重复性。
分析 cuvette 中的样本允许在每个视频中捕获统计随机样本。这可产生更可重复的数据和各种尺寸的粒子可视化。由于在推荐的粒子浓度范围内获取样品可能很困难，因此一定要进行连续稀释，以确定理想的稀释因子。
安东尼·费兰特实验室的博士生蔡坤恒将演示这一程序。要为纳米粒子跟踪分析做好准备，请使用无绒毛材料覆盖工作空间，以防止纤维进入幼崽。戴着手套，将装有搅拌棒的夹具放在磁性小插曲上。
使用钩形工具将插入插入到库维特中，插入的插口在库维特前面可见。使用移液器将 400 到 500 微升纯化的细胞外囊塞慢慢添加到切口上，通过插入孔，通过轻轻的管道混合样品，而不引入气泡，然后盖住小面包，根据需要敲出气泡，并使用无绒布擦拭切口的外部表面。要分析稀释剂或样品的颗粒浓度，请打开计算机工作站和仪器，启动粒子跟踪分析程序。
提示时，单击 NTA 并打开录制选项卡。按照屏幕上的说明填写所有必要的示例信息。对于 EV 跟踪分析，将稀释剂设置为 PBS。
盐度将自动填充到 9% 为了获得稀释物或样品颗粒浓度，请打开仪器盖并取下将 cuvette 放置位置的保护盖。将 cuvette 以正确的方向加载到仪器中，插入器的插件朝面向摄像机，并更换盖子和仪表盖。单击流箭头打开相机并单击雪佛龙箭头以扩展记录设置。
调整对焦，直到相对较小的颗粒清晰可见。要设置小 EV 量化分析，将帧速率设置为每秒 30 帧，曝光时间设置为 15 毫秒，搅拌时间设置为 5 秒，等待时间设置为 3 秒，蓝色、绿色和红色激光动力分别设定为 210、12 和 8 毫瓦，每个视频的帧数设置为 300，增益到 30 分贝。调整对焦，直到相对较小的颗粒清晰可见。
增加变焦和/或增益有助于粒子对焦。但是，如果您增加增益，请记住在录制前将其设置为 30 分贝。一旦粒子处于焦点状态，将变焦设置设置设置为 0.5 倍，以节省带宽并防止丢失帧并单击记录以开始录制视频。
当提示显示已录制视频时，单击"确定"以完成录制并选择过程选项卡。如果在录制时任何视频中都可以看到非常大的颗粒，请导航到录制的视频目录，并在处理之前删除任何有问题的视频。检查禁用音频检测覆盖框，并将功能直径设置为 30。
单击过程以启动视频处理并查看实时分布图。处理完成后，单击"确定"并选择绘图选项卡。对于电动汽车，将主图表显示为日志箱二氧化硅。
图形的其他功能，如更改 x 轴以设置所生成图形的集成区域，可以自定义。要创建结果的 PDF 报告，请单击报告按钮。将显示因稀释因子和分布宽度的平均值、中位数、模式大小和浓度调整。
在任何样品之前应执行二分红的 NTA，以便从 EV 样品颗粒浓度中减去此空白的浓度。要在分析后清洁幼崽，清空幼虫，用去离子水将幼崽完全填满 10 到 15 次，用 70 到 100% 乙醇将三次切除任何残留样品。用无绒毛纤维布干燥幼虫的外部，用压缩空气除尘器干燥内部。
要清洁插入物和搅拌条，将材料放入含有 70 至 100% 乙醇的玻璃闪烁小瓶中，并大力摇动小瓶。然后冲洗插入物，在去离子水中搅拌棒，如所示，摇晃，然后用无绒布将其晾干。干燥后，立即将所有清洁部件放入存储，直到下一次分析。
在进行分析之前，使用聚苯乙烯珠测试仪器校准，以确保获得的数据的有效性。据观察，粒子跟踪仪器准确地报告了100纳米的马诺分散珠的大小，但只密切报告了400纳米珠子的大小。因此，此协议的仪器设置对于体积接近 100 纳米的较小粒子更准确。
使用这些设置，报告的粒子浓度相应地与稀释因子相符，表明仪器能够在各种稀释时准确检测粒子浓度，而技术复制器之间变化不大。每毫升小鼠组织衍生EV样本中4.41倍10至10个粒子的最佳稀释量被确定为1000至3000粒。在此分析中，增加增益可提高相机的灵敏度，从而增加更小颗粒的可视化性。
将蓝色激光功率从 70 毫瓦增加到 210 毫瓦，同时保持绿色和红色激光功率不变，将报告的平均粒子大小从 122 纳米增加到 105 纳米，并将报告的总粒子浓度从 1.1 倍 10 增加到第八倍，从 10 倍增加到第八倍。增加红色激光的功率使报告的平均粒子大小从175纳米增加到246纳米，并降低了报告的总粒子浓度。增加绿色激光功率导致报告的平均粒子大小减少，报告的总粒子浓度增加。
找到合适的稀释，将样品置于最佳检测范围内，可能需要为每个样品尝试几次。库维特清洁还需要格外小心的处理。我们建议在EV粒子大小和浓度测量中应用多种正交方法。
动态光散射、电阻脉冲传感、传输电子显微镜和单粒子干涉反射成像感应也可以对电动汽车进行特征化。
