对电动汽车进行深入表征可能具有挑战性，需要多台仪器来描述各个参数。在纳流式细胞术等单一技术中测量这些关键标准可同时描述多个 EV 亚群。因此，在确定其荧光之前，单独测量每个EV以识别直径大于14纳米的无标记颗粒。
这通过消除误报来形成可靠的数据集。纳米流式细胞术可应用于各种来源的电动汽车，包括富含血浆、脑脊液和培养基的电动汽车。该技术还用于分析病毒、脂质纳米颗粒和纳米材料。
优化标记协议非常重要。与缓冲液中残留的任何荧光相比，这样可以最大化与颗粒相关的任何荧光。首先，打开仪器，加载纳流专业，然后从鞘流下拉菜单中选择启动，将水装入装载区，然后从护套流下拉菜单中选择增压。
将QC珠在0.6微升管中的蒸馏水中稀释1至100，并将其放入装载区以将样品引入系统。然后如前所述将样品提升 45 秒，以完全替换先前的样品、水或清洁溶液。增强时，将激光功率设置为QC珠的预设模板，以250纳米FL QC标准。
稍后，为了降低系统压力，请从同一下拉菜单中选择采样压力，并将自动采样压力设置为一公斤帕斯卡以保持恒定压力。然后通过从采集控件中选择“记录时间”来启动一分钟分析。数据将绘制在点图上，显示侧向散射强度的对数刻度和选定的荧光强度。
在保存文件之前，请插入文件名和样品稀释液。接下来，选择卸载以从装载区中取出管子。用 150 微升清洁溶液替换 QC 珠，并通过选择增强清洁 30 秒以上。
使用装有 150 微升水的管子，通过将尖端浸入水中，从毛细管尖端中去除任何多余的清洁溶液。然后将大小的标准珠在水中稀释 1 至 100，并将 100 微升装入装载区。现在，将激光功率设置为预设模板，S16 EXO 68至155纳米。
此设置适用于尺寸标准和包含小于 200 纳米的 EV 的样品。选择采样并继续记录样品一分钟。用水或PBS样品执行第三次测量，以创建空白测量值，识别假阳性以供软件删除。
将PBS中未标记的EV样品稀释至每毫升1乘以10至8至5倍10至第八颗粒的合适颗粒浓度范围，以进行nFCM分析。并将 10 至 100 微升稀释的样品装入装载舱。如果颗粒浓度未知，则从 EV 样品的 1 到 100 稀释度开始。
样品浓度可以通过增强期间CCD相机上的激光光斑大小或通过在采样期间观察事件突发轨迹来快速近似。加载的样本提升 45 秒后，记录一分钟并保存文件，如前所述。记录后，开始分析此数据，从“采集”选项卡切换到“分析”选项卡并打开保存的NFA文件。
为了获得准确的样品测量，请使用采样测量前进行的两个标准测量来设置样品比较值以及空白值。通过选择尺寸标准文件并使用设置阈值工具，创建用于侧散射到直径转换的尺寸标准曲线。阈值在事件突发跟踪中可见，用于标识将事件视为显著事件所需的最小信号强度。
设置阈值后，检查点阵图参数，X 轴上的 SS-H 或 SS-A 和 Y 轴上的 FITC-A。打开标准曲线生成工具，然后选择 S16 EXO 68 至 155 纳米作为尺寸模板。单击“查找峰”，将峰侧散射强度识别为 68、91、113 或 155 纳米直径的颗粒。
在关闭窗口之前，请检查是否生成了边散射到直径曲线，其 R 值接近 1。设定浓度标准。选择保存的文件，单击计数标准并输入标准的颗粒浓度。
设置标准信息。选择 EV 示例文件并设置阈值。选择空白文件，然后单击设置空白以识别要从样本计数中删除的误报数。
打开 PDF 生成工具后，检查样品的大小、浓度和稀释度。然后显示样品的浓度和颗粒的大小分布。按照手稿中的描述标记 EV 样品后，取 1 微升标记样品，并在 0.6 毫升管中的 PBS 中稀释 1 至 50。
将样品装入装载舱并施加增压压力 45 秒。此外，请确保正确的激光设置并加载适当的镜头。现在，切换到采样压力并选择要记录的时间。
采集一分钟后，命名数据文件并保存。如前所述，卸载样品，用清洁溶液替换，并在加载下一个标记样品之前将清洁溶液提升 30 秒以上。对于 PDF 生成，请应用与之前演示的相同标准。
只有空白测量值的设置方式不同。选择示例文件并设置阈值。选择设门工具，然后使用左键单击绘制一条分隔荧光阳性群体的线。
设置表示的名称和颜色。设置空白文件，然后单击“设置空白”以确定要从每个不同总体中删除的误报数。打开 PDF 生成工具并确定荧光阳性亚群的大小分布、浓度和百分比。
在点图上，更改 Y 轴以显示来自绿色或红色通道的荧光测量值。设置空白并生成 PDF，如前所述。在点图上，将 X 轴设置为 FITC，将 Y 轴设置为 APC。
利用象限工具识别双荧光阳性群体。将名称和颜色设置为代表性，然后打开 PDF 文件并选择荧光子群。C2C12衍生的EV显示约50%的CD9，30%的CD63呈现，70%的人口呈现三种EV标志物中的至少一种。
与总颗粒群相比，单个tetraspanin标记的EV亚群的尺寸分布显示，中位数尺寸较大，约为75至85纳米，小于65纳米的EV更少。SW620衍生的EV显示出大约40%的CD9，7%的CD63呈现和42%的颗粒具有三个标记中的至少一个。SW620衍生的tetraspanin标记的EV在90至110纳米之间显示出更正态的分布和更大的中位数直径，单个tetraspanin阳性亚群之间的分布相似。
膜标记反复显示C2C12和SW620衍生的EV的阳性率为80%。侧向散射强度与C2C12和SW620点图上的FITC强度相关。双倍阳性百分比与四西班牙蛋白阳性百分比非常相似。
CD63标记似乎显示出与膜标记最弱的相关性。有和没有额外膜标记的抗体标记之间的阳性百分比测量值相似。与CD9 EV相比，C2C12衍生的EV荧光群的平均荧光强度表明CD63和CD81的呈现较低，而SW620表明使用所有三种抗体比任何单个抗体标记提供更大的荧光信号在该协议中，常见的EV标志物已被荧光标记，但可以选择许多抗体靶标来显示EV来源， EV功能或疾病状态。
