尿道感染小鼠模型产生的单细胞内细菌群落的分离, 用于下游单细胞分析

在已给予实验性尿路感染的小鼠中观察到细胞内细菌群落（IBC）。他们也在人类UTI患者的尿液沉淀物中见过。我们今天描述的技术是将单个 IPC 与受实验感染的小鼠隔离为一种方法。

口腔微管技术是目前唯一可用的将细胞内细菌从受感染的小鼠膀胱中隔离出来的技术。要准备玻璃口移液器，请用力捏紧玻璃毛细管的两端，沿其轴沿其轴沿明火源均匀旋转管的中间。当玻璃变软时，从热源中取出毛细管，并立即将玻璃拉开。

拉毛细管的理想最终长度比未拉毛细管长三到五厘米，以确保隔离单个膀胱上皮细胞的内径适当。当玻璃冷却后，检查玻璃毛细管的中间是否较窄，管内是否仍然空心。用一只手拾起拉毛细管的大端，用钳子在最窄的点上抓住毛细管，确保用足够的力握住毛细管，而不压碎毛细管。

快速扭动钳子，在最窄的点捕捉拉毛细管。然后，将嘴微管大小的毛细管放在100毫米培养皿中，紫外线消毒30分钟。要收获膀胱，请将鼠标放在上呼吸处，用70%乙醇对腹部区域进行消毒。

使用乙醇消毒钳和手术剪刀，在尿道开口上方进行初始一厘米横切皮肤切口，并斜线向小鼠上肢倾斜切口，沿小鼠的整个前部创建 V 形切口，以暴露内膜的内容。使用新的灭菌工具，轻轻推下小鼠骨盆区域附近的脂肪垫，使膀胱突出并抓住顶点暴露的膀胱。牢牢抓住膀胱，切开尿管和尿道以释放膀胱，并将一轴圆钳的尖端插入膀胱的开口，在那里它刚刚被切除。

松开抓住顶点并保持圆钳几乎完全关闭的钳子，使用第二对钳子轻轻地将膀胱嘴的外端从圆钳中拉离，并围绕和超过圆钳的另一端，将膀胱从内到外。然后，使用第二对钳子轻轻地将倒置的膀胱从钳子的尖端哄成一毫升的冷 PBS。用两对干净的钳子轻轻刮擦倒置膀胱外层的内皮细胞层。

当所有细胞都刮擦后，将拉制玻璃毛细管的未拉端插入吸气管的橡胶塞中，并将一毫升移液器尖端的窄端紧密地插入管的另一端。将两毫升吸气移液器的窄端紧贴到一毫升移液器尖端的开、宽端，将刮伤的细胞悬浮液置于解剖显微镜下。使用 20 到 40 倍的放大倍率，将 IBC 识别为大型荧光聚合体，将玻璃毛细管的细端浸入新的 PBS 管中一秒钟，以减少通过毛细管作用吸收不必要的体积。

找到感兴趣的 IBC 时，缓慢地将毛细管的开端朝 IBC，并将非常小的吸力施加到吸气移液器上，以引导 IBC 进入玻璃毛细管。然后，将毛细管移动到空的 1.5 毫升离心管中，并施加轻微的正压，将液滴和 IBC 排入管中。除了通过解剖显微镜确认收集管中存在单个隔离的 IBC 外，隔离 IBC 的纯度可通过共和显微镜确认。

分离的细胞应染色的大肠杆菌和尿素，应介于50至120微米之间。分离后，通过基因组等价物的聚群体形成单元定量或定量聚合酶链反应，可以确认单个 IBC 中细菌细胞的存在和生存能力。值得注意的是，用相同协议分离的未感染的上皮细胞不能显示可量化的细菌量。

此外，定量逆转录聚合酶链反应分析证实在一系列单独分离和汇集的 IBC 中存在细菌基因。始终确保口腔微管能够轻松拾取和排出液体。如果口腔微管感觉被遮挡，请毫不犹豫地更换毛细管或整个设备。

这种口腔微管技术使我们能够直接和具体地研究在实验UTI期间形成细胞内种群。如果没有这种技术，这些细胞内种群将被细胞外细菌污染，并超过细胞外细菌。其他一些传染性病原体可能比我们在此应用中使用的大肠杆菌更容易气溶胶或传播。

因此，在这些情况下，可能需要一些额外的控制措施，例如添加过滤器或扩展管材，具体取决于使用的应用程序。然后，使用这种口腔微管技术分离的 IBM 可用于其他下游单细胞分析，如 QRTPCR 或 RNA 测序。