在这里，我们提出了一个可靠的协议，用于检测活检膀胱组织内的细菌，它具有广泛的应用，适用于许多组织类型，其中细菌被怀疑存在。这种技术的主要优点是它不偏不倚。它允许研究人员在事先不知道存在哪些细菌物种的情况下检测组织内的细菌。
这种技术可能有助于确定细菌是否侵入了复发性尿路感染妇女的膀胱壁，并告知治疗选择，如组织穿透抗生素的选择。虽然此技术专为膀胱组织而设计，但可以广泛应用于具有常驻细菌群的其他组织，并采用最少的优化。对这项技术有新一线的人可能会为盖玻片放置和成像而挣扎。
专注于优化盖玻片放置，以减少气泡，并练习对非珍贵样品进行成像。帮助演示这个程序的将是贾什卡兰·加德维，一个研究生在我的实验室。要开始此过程，请清洁空烟罩或用 70% 乙醇适当安装的生物安全柜。
准备文本协议中概述的所有必要的缓冲液和试剂。接下来，用70%乙醇清洁5个Coplin罐子，让罐子干涸。当罐子干燥时，请标注此处所示，并加注 100 毫升的适当溶液。
在烟罩中，将每个活检的两张幻灯片放入垂直滑动架中。将垂直滑动架放入 Xylenes 1 科普林罐中 10 分钟。在此之后，从罐子上取下滑架，并在纸巾上印上底部以去除多余的二十二环。
将机架放入 Xylenes 2 罐中 10 分钟。然后在连续乙醇中重新补充去石蜡组织部分的水分，每次洗涤10分钟。洗完后，在纸巾上印上滑架底部，以去除多余的乙醇，将滑架放在包含 100 毫升滤液的 Colin 罐中，经过 10 分钟的双蒸馏水。
在洗涤过程中，将探头稀释至杂交缓冲液中的 10 纳米摩尔，以创建染色溶液，确保每张幻灯片准备 150 微升染色溶液。通过向 P1000 尖端箱的储液罐中加入浸泡、皱褶的细腻任务擦拭和无菌水，为每个探头准备一个加湿室。将尖端支架墨盒放在顶部，因为这是幻灯片的位置。
完成最后一次洗涤后，从滑架上取下幻灯片，将其放在干净的纸巾上，组织侧向上。使用精细的任务擦拭干燥幻灯片，小心只轻轻擦拭附近，但不是在活检部分，以灯芯离开水。使用疏水笔，在活检部分周围绘制边框，将滑动组织侧向上放在加湿室中。
接下来，将加湿室放入温度为 50 摄氏度的培养箱中。直接在组织顶部的染色溶液的 50 到 150 微升之间的移液器，使组织周围疏水边界制作的矩形被填充并轻轻地关闭盒子。在黑暗中在50摄氏度下孵育。
如果孵化器有一个窗口，覆盖它机智铝箔创造一个黑暗的环境。第二天早上，从加湿室中取下幻灯片，然后用细腻的任务擦拭快速清除任何剩余的杂交溶液。然后将两侧放入垂直染色架中。
将染色架放入铝箔包裹的科普林罐中，内含 100 毫升预热洗涤缓冲液，使用 10 分钟。用新的科普林罐中的新洗涤缓冲液再重复此洗涤步骤两次。在这些洗涤步骤中，通过稀释洗涤缓冲液中的 Hoechst 33342 库存溶液，以 1 比 1000 的比例准备防污。
在同一管上，将Alexa-555小麦胚芽凝糖蛋白加入每毫升5微克的最终浓度，将Alexa-555法罗酮的最终浓度添加到33纳米摩尔。储存在黑暗中，直到准备好使用。完成最后一次洗涤后，从 Coplin 罐子中取下幻灯片，然后用细腻的任务擦拭轻轻擦去多余的洗涤缓冲液。
将幻灯片放在纸巾上，将 50 到 150 微升的反污剂直接添加到纸巾顶部，以便填充疏水边框，但不会溢出。最多四张幻灯片，顶部有低温盒，在室温下孵育 10 分钟。在此之后，将幻灯片放回染色架中，在含有新鲜洗涤缓冲液的科普林罐中再次清洗两次，每次洗涤持续 10 分钟。
然后彻底干燥幻灯片，将纸巾放在冷冻盒顶部的纸巾上。将一滴安装介质直接挤压在组织顶部，轻轻将适当大小的盖玻片放在顶部。轻轻压出任何气泡，让盖玻片滑梯在黑暗中过夜固化。
第二天，用透明指甲油的浅色涂层将盖玻片的边缘密封在幻灯片上，让在黑暗中干燥10分钟，然后将它们储存在黑暗中4摄氏度。当准备好对染色活检进行成像时，请打开共生显微镜和与显微镜相关的软件。从 FISH 正幻灯片开始，切换到计算机可视化模式。
选择 405、488 和 555 的通道。使用最长的波长通道设置针孔，在这种情况下，该通道为 555。然后查找当前焦点平面，用于在 488 通道中对标记细菌进行可视化。
在不更改焦平面的情况下，设置每个通道的增益、激光功率和偏移，使信号未饱和且背景不会过度校正。在所有三个通道中获取图像。在这项研究中，组织相关的细菌被16S rRNA FISH在人类膀胱活检中检测到。
该协议已针对与石蜡嵌入膀胱活检部分膀胱粘膜相关的细菌的公正检测进行了优化。此处显示的是使用此协议对从复发性尿路感染妇女获得的膀胱活检部分进行的实验的代表性共生显微图。两个串行部分与通用 16S rRNA 或争先恐后探头混合。
从组织和细菌的同一区域拍摄的图像在与16S rRNA探针混合的组织中清晰可见，但与争抢探针没有。假阳性结果也是可能的。在此代表性假阳性中，在 16S rRNA 和争先恐探混合活检部分的 405 和 488 通道中检测到与自荧光胶原蛋白或弹性蛋白对应的信号，突出了始终使用争先探针控制的重要性。
为了防止光漂白，在应用探头后尽量减少组织暴露在光线下。虽然这种技术允许对人体组织中细菌进行公正检测，但它没有提供物种特定的信息。具有分类特定探测器的多路复用鱼种可用于识别存在的属或物种。
在开发这项技术之前，以前没有证明细菌会侵入人类复发UTI患者的膀胱壁。我们现在使用属和物种特定的探测器来确定哪些细菌物种存在。由于烟罩的毒性，应使用 Xylenes。
在成像过程中，应注意不要直视激光。将幻灯片定位在目标下时，应关闭激光。
