細胞内細菌群集(IPC)は、実験的な尿路感染症(UTI)を与えられたマウスで観察されている。彼らはまた、人間のUTI患者の尿沈尿で見られてきた。私たちが今日説明している技術は、実験的に感染したマウスから単一のIPCを分離する方法です。
口マイクロピペット技術は、感染したマウス膀胱から細胞内細菌を単離するための唯一の現在利用可能な技術です。ガラス口ピペットを準備するには、ガラスキャピラリーチューブの両端をしっかりとつまみ、チューブの中央を軸に沿って均等に回転させて、開いた炎の源に沿って回転させます。ガラスが柔らかくなったら、熱源から毛細血管を取り出し、すぐにガラスを引き離します。
引っ張られた毛細管の理想的な最終的な長さは、単一の膀胱上皮細胞を単離するための適切な内径を確保するために、引っ張られていない毛細血管よりも3〜5センチメートル長い。ガラスが冷えたら、ガラスの毛細管の真ん中が狭いかどうか、そしてチューブの内部がまだ中空であるかどうかを確認してください。片手で引っ張られた毛細血管の大きな端を拾い、鉗子を使って最も狭いポイントで毛細管をつかみ、鉗子がキャピラリーを押しつぶさずにしっかりと握るのに十分な力で振り回されるようにします。
鉗子を素早くねじって、引っ張られた毛細管を最も狭いポイントでスナップします。その後、100ミリメートルペトリ皿に口マイクロピペットサイズの毛細管を入れ、30分間皿をUV殺菌します。膀胱を収穫するには、マウスをスピーヌ位置に置き、70%エタノールで腹部を殺菌する。
エタノール殺菌鉗子と手術用ハサミを使用して、尿道開口部の上に最初の1センチメートルの横方向皮膚切開を行い、マウスの上肢に向かって斜めに切開を拡大し、腹膜の内容物を露出させるマウスの前部全体に沿ってV字型の切り口を作ります。新しい殺菌された用具を使用して、マウスの骨盤領域の近くの脂肪パッドを静かに押し下げて、膀胱を突き出して、露出した膀胱を頂点でつかむ。膀胱をしっかりと握り続け、尿管と尿道を切って膀胱を解放し、丸みを帯びた鉗子の1つのシャフトの先端を膀胱の開口部に挿入し、切開したばかりでした。
頂点をつかんで丸みを帯びた鉗子を離し、丸みを帯びた鉗子をほぼ完全に閉じたままにし、2番目の鉗子を使用して、丸みを帯びた鉗子から膀胱の口の外側の端を静かに引っ張り、丸みを帯びた鉗子の他の先端を引き離して膀胱を裏返します。次に、2番目の鉗子を使用して、鉗子の先端から1ミリリットルの冷たいPBSに逆膀胱を穏やかに同化させる。そして、2組のきれいな鉗子で、逆膀胱の外側の内部上皮細胞層をそっと削ります。
すべての細胞が削られたら、引っ張られたガラスの毛細血管の抜かれた端を吸引管のゴムプラグに挿入し、1ミリリットルのピペット先端の狭い端をチューブのもう一方の開いた端にしっかりとフィットさせます。2ミリリットルの吸気ピペットの狭い端を1ミリリットルのピペットチップのオープン、より広い端にしっかりとフィットさせ、切り取った細胞懸濁液を解剖顕微鏡の下に置きます。20~40倍の倍率を使用して、IBCを大きな蛍光凝集体として識別し、ガラスキャピラリーの細かい端をPBSの新鮮なチューブに1秒間浸し、毛管作用による不要な体積の取り込みを減らします。
関心のある IBC が見つかったら、ゆっくりと IBC に向かってキャピラリーチューブの開いた端を持って、IBC をガラスの毛細血管に導くため、非常に小さな吸引力をピペットに適用します。次に、キャピラリーを空の1.5ミリリットルの遠心分離管に移動し、わずかな正の圧力を加え、液滴とIBCをチューブに排出します。解剖顕微鏡を介してコレクションチューブ内に単一の単一の単一のIBCの存在の確認に加えて、単離されたIBCの純度は共焦点顕微鏡によって確認することができる。
単離された細胞は、大腸菌とウロプラキンの両方に染色する必要があり、50〜120マイクロメートルの大きさでなければなりません。単離後、個々のIBCにおける細菌細胞の存在および生存率は、ゲノム等価物に対するコロニー形成単位定量または定量的ポリメラーゼ連鎖反応を通じて確認することができる。特に、同じプロトコルで単離された感染していない上皮細胞は、定量化可能な量の細菌を示さない。
また、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応解析は、個別に単離およびプールされたIPCの範囲内に細菌遺伝子が存在するのを確認する。常に口マイクロピペットが容易に液体を拾い、排出できることを確認してください。口マイクロピペットが閉塞感じた場合は、キャピラリーまたは装置全体を変更することを躊躇しないでください。
この口マイクロピペット法により、実験的なUTI中に形成される細胞内集団を直接、具体的に研究することができます。この技術がなければ、これらの細胞内集団は細胞外細菌に汚染され、劣勢になるだろう。いくつかの他の感染因子は、我々がこのアプリケーションで使用した大腸菌よりもエアロゾル化または送信が容易である可能性があります。
このような場合、使用するアプリケーションによっては、フィルタの追加やチューブの拡張など、いくつかの追加のコントロールが保証される場合があります。この口マイクロピペット法を用いて単離されたIPCは、QRTPCRやRNAシーケンシングなどの他の下流単細胞解析に使用することができます。
