需要一种准确、高通量的方法来测量RSV中和抗体，作为防止呼吸道合体病毒的重要标志。这种方法具有高度可重复性，中间测定变异的参考抗性抗性低于10%。我们相信，这种测定可以以相对较低的成本在全球许多实验室中轻松建立。我们在这里描述一种基于成像的微中和检测，该测定在RSV子组 A 上进行了测试，也可以适用于 RSV 子组 B 和不同的样本类型。
演示该程序将是鲁本谢，在MCRI的研究团队的成员。在第一天播种板，首先在DMEM介质中重新释放 A549 细胞，每毫升浓度为 40 万细胞，使用 10%FCS 和 1，000 个单位青霉素-链霉素混合物。然后用4万个 A459细胞播种96孔平底无菌板，密度为每井100微升。
在5%的二氧化碳环境中孵育37摄氏度的板。要在第二天准备血清稀释，首先在室温下解冻人体RSV参考血清和血清测试样品。然后将它们放在56摄氏度的水浴中30分钟加热并激活它们。
接下来，通过将参考血清的1.5微升与不含FCS的DMEM介质与青霉素-链霉素混合物混合到150微升的最终体积，准备110多微升的参考血清稀释剂。移液器 110 微升这种稀释成井 A12 的 96 井 U 底部无菌板。要连续一至两次稀释板，首先添加55微升的FCS无DMEM介质与青霉素-链霉素混合物到井B12至H12。
然后用新的尖端转移 55 微升从井 A12 到井 B12。上下移液五次混合解决方案，并一直持续到您达到好H12。从 H12 井中移掉溶液的多余的 55 微升。
接下来，准备一至百份血清测试样品稀释，并将每份稀释的110微升加入相应的A1至96孔无菌板的E9。然后添加55微升的FCS无DMEM介质与青霉素-链霉素混合物到井一至九列。如前面所述，将行 A 到 D 行以及从行 E 到 H 行进行一到两次序列稀释。
将 55 微升不含 FCS 的 DMEM 介质与青霉素-链霉素混合物添加到第 10 列和 11 列的井中。为了准备病毒库存，首先将RSV冷冻小瓶放入37摄氏度的水浴中快速解冻，然后将小瓶放在冰上。接下来，将病毒添加到含有青霉素-链霉素混合物的DMEM介质中，每口约200PFU，使100口井的总体积为55毫升。
为了准备病毒血清混合物，首先将55微升稀释病毒添加到第1至9列的所有孔中，以及10列和11列的E行至H型井。然后将55微升不含FCS的DMEM介质与青霉素-链霉素混合物添加到10和11列的行从D的所有孔中，在37摄氏度的20%二氧化碳环境中孵育板一小时。在接种具有RSV的 A549 细胞之前，在光学显微镜下检查细胞板，确认 A549 细胞单层是 80% 汇合。
然后轻轻反转板，丢弃介质，轻轻将板印在无菌吸水纸巾上。每次后，用过滤的无菌PBS清洗。接下来，根据手稿中提供的板模板，将病毒血清混合物每孔的100微升添加到A549细胞板上的相应孔中，并在37摄氏度的2氧化碳中孵育该板一小时。
在孵化结束时，使用移液器去除每井90微升，并在青霉素-链霉素混合物中加入100微升介质，其中含有1XM199、1.5%CMC和2%FCS。在37摄氏度的二氧化碳中孵育37摄氏度，为期三天。要修复和开发检测板，首先轻轻反转受RSV感染的 A549 细胞板，丢弃含有 M199、CMC、2%FCS 和青霉素-链霉素混合物的介质。
然后慢慢向每一井添加200微升固定缓冲液。在零下20摄氏度下孵育板20分钟。然后丢弃固定缓冲液，轻轻印在吸水纸巾上。
将板面向下晾干 10 分钟。然后用过滤PBS缓冲液含有05多糖酸20，使5%牛奶阻断溶液。在每个井中加入200微升的阻消溶液，并在室温下孵育板30分钟。
在孵育结束时，轻轻反转板，丢弃吸水纸巾上的溶液和印迹。要制造原抗体，在阻断溶液中稀释一至500只山羊XRSV抗体。在每个井中加入50微升，在37摄氏度下孵育板一小时。
用过滤的PBS-多糖酯清洗板三次。接下来，在阻断溶液中稀释一至五千头亚历克萨氟尔驴抗山羊免疫球蛋白G，使二次抗体产生。在每个井中加入50微升，在37摄氏度下孵育一小时。
用过滤的PBS-多糖酸清洗盘子五次。要使用自动点读取器对斑块进行计数，请首先使用未使用的 96 井培养板通过输入 FITC 通道中的计数设置来协作仪器。然后读取细胞板，用铝箔包裹，并将其存放在摄氏四度。
接下来，检查孔的图像，寻找神器斑块或中断的细胞单层，并排除带中断的细胞单层井。计算了无血清控制井的斑块平均数量，用于确定50%中和截止，这将导致50%抑制病毒活性。从两点之间绘制的一条线上绘制了对等血清稀释图，并在半日志图的 y 轴上绘制了斑块数。
测试血清样本的50%中和滴答是红色的，血清稀释量高于或低于无血清控制井50%值。RSVAPRN在来自冈比亚的两个不同的成人群体和墨尔本的健康志愿者中进行检测，导致冈比亚成年人的NAB滴答声比墨尔本成年人低。显示的人类RSV参考血清表现出非常低的变异性，变异系数为6.82% 这种改进的高通量RSV斑块还原中和测定可以轻易地在许多实验室中实施，并将支持世卫组织对RSV中和抗体测定的国际协调努力。
这对于未来对新型RSV疫苗候选者的评价至关重要。
