C'è bisogno di un metodo accurato e ad alta produttività per misurare gli anticorpi neutralizzanti RSV, come importante marcatore di protezione contro il virus respiratorio sinciteale. Questo metodo è altamente riproducibile con variazioni inter-test per l'antisiero di riferimento inferiore al 10%Crediamo che questo saggio possa essere facilmente stabilito in molti laboratori in tutto il mondo a costi relativamente bassi. Descriviamo qui un saggio di micro-neutralizzazione basato sull'imaging che è stato testato sul sottogruppo RSV A e può anche essere adattato per il sottogruppo RSV B e diversi tipi di campione.
A dimostrare la procedura sarà Reuben Tse, membro del gruppo di ricerca di MCRI. Per seminare piastre il primo giorno, riutilizzare per la prima volta le cellule A549 nei supporti DMEM, con 10%FCS e 1.000 unità miscela Penicillina-Streptomicina ad una concentrazione di 400.000 cellule per millilitro. Quindi seminare piastre sterili a fondo piatto da 96 po 'con 40.000 cellule A459 ad una densità di 100 microlitri per pozzo.
Incubare la piastra a 37 gradi Celsius in un ambiente di anidride carbonica del 5% durante la notte. Per preparare la diluizione del siero il secondo giorno, scongelare prima il siero di riferimento RSV umano e i campioni di prova del siero a temperatura ambiente. Quindi mettili in un bagno d'acqua a 56 gradi Celsius per 30 minuti per riscaldarli e attivarli.
Successivamente, preparare più di 110 microlitri di una diluizione da uno a 100 del siero di riferimento mescolando 1,5 microlitri del siero di riferimento con supporti DMEM senza FCS con miscela Penicillina-Streptomicina ad un volume finale di 150 microlitri. Pipetta 110 microlitri di questa diluizione in pozzo A12 di una piastra sterile con fondo a U da 96 po '. Per effettuare diluizioni seriali da uno a due lungo la piastra, aggiungere prima 55 microlitri di supporti DMEM senza FCS con miscela Penicillina-Streptomicina ai pozzi da B12 a H12.
Quindi con una nuova punta trasferire 55 microlitri dal pozzo A12 al pozzo B12. Pipettare su e giù cinque volte per mescolare la soluzione, e continuare fino a raggiungere bene H12. Pipettare fuori gli eccesso di 55 microlitri della soluzione dal pozzo H12.
Successivamente, preparare una diluizione da uno a 100 di campioni di prova del siero e aggiungere 110 microlitri di ogni diluizione ai pozzi corrispondenti da A1 a A9 ed E1 a E9 della piastra sterile da 96 po '. Quindi aggiungere 55 microlitri di supporti DMEM senza FCS con miscela Penicillina-Streptomicina ai pozzi nelle colonne da uno a nove. Effettuare diluizioni seriali da una a due della riga A alla riga D e dalla riga E alla riga H come descritto in precedenza.
Aggiungere 55 microlitri di supporti DMEM senza FCS con miscela Penicillina-Streptomicina ai pozzi nelle colonne 10 e 11. Per preparare lo stock di virus, prima metti una fiala congelata di RSV in un bagno d'acqua di 37 gradi Celsius per scongelarla rapidamente, quindi posiziona il flaconcino sul ghiaccio. Successivamente, aggiungere il virus al supporto DMEM contenente miscela Penicillina-Streptomicina a circa 200 PFU per pozzo per fare un volume totale di 55 millilitri per 100 pozzi.
Per preparare la miscela di siero virale, aggiungere prima 55 microlitri del virus diluito a tutti i pozzi delle colonne da uno a nove e pozzi di righe da E a H delle colonne 10 e 11. Quindi aggiungere 55 microlitri di supporti DMEM senza FCS con miscela Penicillina-Streptomicina a tutti i pozzi di file da A a D delle colonne 10 e 11 e incubare la piastra a 37 gradi Celsius in un ambiente di anidride carbonica al 5% per un'ora. Prima dell'inoculazione delle cellule A549 con RSV, esaminare la piastra cellulare al microscopio leggero per confermare che i monostrati cellulari A549 sono confluenti all'80%.
Quindi invertire delicatamente la piastra per scartare il supporto e asciugare leggermente la piastra su un tovagliolo di carta assorbente sterile. Dopo ciascuno, lavare con PBS sterile filtrato. Aggiungere quindi 100 microlitri per pozzo della miscela di siero virale ai pozzi corrispondenti sulla piastra cellulare A549 in base al modello di piastra fornito nel manoscritto e incubare la piastra a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5% per un'ora.
Al termine dell'incubazione, utilizzare una pipetta per rimuovere 90 microlitri per pozzo e aggiungere 100 microlitri del supporto contenente 1XM199, 1,5%CMC e 2%FCS nella miscela Penicillina-Streptomicina. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius in anidride carbonica al 5% per tre giorni. Per fissare e sviluppare una piastra di dosaggio, invertire prima delicatamente la piastra cellulare A549 infetta da RSV per scartare delicatamente il supporto contenente M199, CMC, 2%FCS e la miscela Penicillina-Streptomicina.
Quindi aggiungere lentamente 200 microlitri di Fixation Buffer ad ogni pozzo. Incubare la piastra a meno 20 gradi Celsius per 20 minuti. Quindi scartare il tampone di fissazione e tamponare delicatamente su un tovagliolo di carta assorbente.
Lasciare asciugare la piastra a faccia in giù per 10 minuti. Quindi, con tampone PBS filtrato contenente 05 polisorbato 20, fare soluzione di blocco del latte al 5%. Aggiungere 200 microlitri della soluzione di blocco ad ogni pozzo e incubare la piastra a temperatura ambiente per 30 minuti.
Al termine dell'incubazione invertire delicatamente la piastra per scartare la soluzione e tamponare su un tovagliolo di carta assorbente. Per realizzare l'anticorpo primario, diluire da uno a 500 anticorpi XRSV di capra nella soluzione di blocco. Aggiungere 50 microlitri ad ogni pozzo e incubare la piastra a 37 gradi Celsius per un'ora.
Lavare la piastra tre volte con PBS-polisorbato filtrato. Successivamente, fare l'anticorpo secondario diluire da uno a 5.000 Alexa Fluor anti-capra immunoglobulina G nella soluzione di blocco. Aggiungere 50 microlitri ad ogni pozzo e incubare a 37 gradi Celsius per un'ora.
Lavare la piastra cinque volte con PBS-polisorbato filtrato. Per contare le placche con un lettore di spot automatizzato, utilizzare prima una piastra di coltura inutilizzata da 96 pozzi per collaborare allo strumento inserendo le impostazioni di conteggio nel canale FITC. Quindi leggere la piastra cellulare, avvolgerla in un foglio e conservarla a quattro gradi Celsius.
Quindi, controlla le immagini dei pozzi alla ricerca di placche artefatto o monostrati cellulari interrotti ed escludi i pozzi con monostrati cellulari interrotti. Il numero medio di placche dei pozzi di controllo senza siero è stato calcolato e utilizzato per determinare il taglio di neutralizzazione del 50% che avrebbe determinato un'inibizione del 50% dell'attività del virus. La diluizione reciproca del siero è stata tracciata sull'asse x e il numero di placche sull'asse y di un grafico semi-log da una linea tracciata tra i due punti.
I titoli di neutralizzazione del 50% dei campioni di siero di prova erano diluizioni rosse e siere con conteggi immediatamente superiori o inferiori al valore del 50% dei pozzi di controllo senza siero. I test RSVAPRN in due diverse coorti adulte del Gambia e volontari sani a Melbourne hanno portato gli adulti gambiani ad avere un titolo NAB medio inferiore rispetto agli adulti di Melbourne. Il siero di riferimento RSV umano mostrato dimostra una variabilità molto bassa con il coefficiente di variazione del 6,82%Questo test di neutralizzazione della riduzione della placca RSV ad alta produttività migliorato può essere facilmente implementato in molti laboratori e sosterrà lo sforzo di armonizzazione internazionale dell'OMS per i test anticorpali neutralizzanti RSV.
Questo sarà fondamentale per la valutazione dei nuovi candidati al vaccino RSV in futuro.
