rad51 介导的 dna 链交换反应的实时观测

该方法有助于破译DNA链交换的步骤，揭示修复过程中结合的不同蛋白质的分子作用。通过这项技术，我们可以实时监测DNA链交换，而不会对反应造成任何干扰，并使用手术室确定每个反应步骤的动力学。通过一些小的调整，该技术可以应用于研究从其他物种（如哺乳动物和植物）衍生的纯化重组蛋白的活动。

演示程序将是肯塔罗伊藤， 一个后医生从我的实验室。首先，根据文本协议准备反应缓冲区 A。接下来，在缓冲液中加入36纳米莫16FA-寡核苷酸，进行DNA配对测定。

在37摄氏度下孵育混合物5分钟。将RAD-51蛋白以1.5微摩尔的最终浓度加入混合物中，并在37摄氏度下孵育5分钟。将SWI5-SFR1蛋白以0.15微摩尔的最终浓度加入混合物中，并在37摄氏度下再孵育5分钟。

在含有磁力搅拌器的 1.0 x 1.0 厘米石英盒中转移 1.5 毫升混合物。将库放入光谱荧光计中，然后继续调节温度控制器和磁力搅拌器。记录在493纳米激发时，FAM荧光发射在525纳米时的变化，间隔100秒。

最后，用注射器将ROX标签的双链DNA注射到36纳米摩尔的最终浓度中。以一秒间隔记录荧光发射的变化，间隔 30 分钟。要比较基材和最终产品之间的荧光光谱，请将含有带RAD-51的16个FA-寡核苷酸的每个库子插入光谱荧光计，并在37摄氏度下孵育5分钟。

然后，在493纳米的激发下，记录500至600纳米的 FAM 荧光发射。要测试RAD-51对荧光光谱的影响，请以1.5微摩尔的最终浓度加入RAD-51。在37摄氏度下孵育混合物5分钟。

最后，在493纳米的激发下记录荧光光谱从500纳米到600纳米。当所有单链DNA基质在配对测定中转化为双链DNA时，通过测量荧光强度的最大降低，可以获得最大的F FRET效率。或者通过测量当所有双链DNA基质在位移测定中转化为单链DNA时强度的最大增加。

在这两种测定中，RAD-51蛋白的添加不会影响 FAM 的荧光发射或岩石的淬火效率。基板DNA与随后的光漂白之间的自发反应影响较小。如与RAD-51相比，没有RAD-51的 FAM 排放量变化微不足道。

添加 SWI5-SFR1 复合体可强烈刺激 RAD-51 的配对活动。使用三步模型模拟配对反应，包括形成第一个三股中间体，过渡到第二中间体，释放单链DNA和形成异质双面。将三步模型与两步模型进行比较表明，三步模型更适合模拟DNA配对，无需或与 SWI5-SFR1 复合物匹配。

每个反应步骤的计算平衡常数（带或不带 SWI5-SFR1）表明，SWI5-SFR1复合物不会刺激前三链中间体的形成，而是强烈刺激两个三链中间体之间的过渡和 SS DNA 的释放。验证每批纯化蛋白是否无核酸酶和直升机污染至关重要。