实现蛋白质快速光化学氧化的实时补偿，用于确定蛋白质地形变化

该方法有助于蛋白质确认和蛋白质相互作用的测量。缓冲液成分、样品纯度和蛋白质浓度要求灵活，允许该方法解决具有挑战性的结构问题。此技术允许在各种不同的缓冲系统中压缩样本。

使用我们的剂量测定法，研究人员可以实时监测他们的标签反应的实时工作情况。这项技术的一个应用是药物开发，因为它允许研究人员测试广泛不同的药物配方，以及它们如何影响蛋白质结构。准备FPOP光学工作台。

首先打开激光，将激光设置为外部触发器，恒定能量，无需更换气体。当激光加热时，将每个脉冲的激光能量设置为每个脉冲 80 到 120 毫克，并使用丁烷割炬在激光照射后以 265 纳米的速度读取 265 纳米的吸水信号时轻轻燃烧毛细管的聚酰胺编码。使用无绒擦拭和甲醇轻轻擦拭毛细管中的碎屑，并通过激光的光束路径将清洁的毛细管放入内联剂量计中。

按下内联剂量计顶部的操纵杆以打开铰链并拆下磁座。使用磁力支架将毛细管放在内联剂量计的机器槽中，以保持毛细管就位，并关闭压铰链的毛细管铰链，直到操纵杆锁定到位。单击剂量测量软件中的启动闪光灯按钮，开始发射兴奋激光，并在剂量测量软件中设置 10 到 20 赫兹的预设重复率，激光发射通过其运动范围移动电动舞台，确保光束保持居中于孔径，并且毛细管的轮廓在整个过程中可以观察到。

然后以每分钟 20 微升的速度用水冲洗毛细管至少一分钟，然后单击 dosimeter 软件中的启动数据加上自动零，在开始数据收集之前将剂量计归零。要执行 FPOP 实验，在 18 微升 FPOP 溶液中加入两个过氧化氢微升，并使用移液器轻轻混合溶液，通过离心快速收集管底溶液，并立即使用气密注射器将溶液装入注射器泵中。单击 dosimeter 软件中的启动泵和启动数据，以适当的流速启动注射器泵上的流量，并使用内联剂量计监控实时腺苷读数，直到 265 纳米的吸水信号稳定在废物容器中收集样品。

要开始以预设重复速率发射激光结束能量，请单击剂量计软件中的启动闪光按钮，并使用内联剂量计监控实时腺素读数。激光关闭和激光打开时 265 纳米的吸光度差异将是 265 纳米读数的增量吸收量。确保可与不同样品中的蛋白质发生反应，使类似的羟基基发生反应。

将获得 265 纳米读数的增量吸收度与内联剂量计与从先前实验或控制中获得的 265 纳米读数时获得的欲望增量吸收量进行比较。如果读数处于所需水平，则在淬火缓冲液中激光或辐射后立即采集样品。为了补偿有效基量以平衡吸收度读数，改变过氧化氢浓度，改变每个脉冲的激光能量或改变对焦透镜的焦平面以增加激光的荧光度。

使三角洲吸收剂读数中大于 10 毫的吸水单位变化，请用或多或少的过氧化氢重新制作样品，然后重新运行样品，如所示。要实时对吸光度读数进行小变化，请使用 50 毫米电动舞台调整对焦透镜的位置，以调整射点光束的焦平面。在激光辐射实时监测265纳米的腺氨酸三角洲吸收剂后，测量样品中存在的羟基基的有效量，使用电动级内联紫光毛细管探测器调整透镜位置，直到265纳米读数的增量吸收量与所需读数相等。

比较磷酸盐缓冲液中亚迪卢马布生物仿制药的重链肽足迹，在55摄氏度加热一小时后发现，当蛋白质被加热形成聚合体时，指示的肽区域显示出对溶剂的显著保护。使用内联剂量计实时监测激光或辐射之前和之后腺苷吸收剂的差异，表明与磷酸盐缓冲液相比，在 MES 缓冲液中观察到腺素吸收剂水平的可比变化。与磷酸盐缓冲液相比，在存在 MES 缓冲液的情况下，肽的平均氧化度较低。

然而，随着激光荧光的增加，具有相等的腺苷剂量测定反应，平均肽氧化值几乎相同后FPOP和MES缓冲液和磷酸盐缓冲液。由于剂量读数受激光过氧化物浓度以及激进清除器的影响。注意样本调查之间的剂量反应彼此接近。

站点定向突变通常用于探测 FPOP 中受保护的站点。这使得研究人员能够确定变化是否由阿利斯泰尔决定。该技术有助于比较不同缓冲液或配方中的蛋白质，使研究人员能够确定不同添加剂对蛋白质确认的影响。