一种在裂变酵母中的深度固序辅助自发抑制屏

该协议描述了一个简单而有效的抑制器屏幕，用于识别在裂变酵母中具有生长缺陷的突变体中的抑制剂突变。传统的诱变方法使用有毒化学物质或紫外线，可以在细胞中产生多个突变。相反，该协议可以丰富单个细胞中的单个抑制突变，而无需使用突变诱导方法。

从应变构造和准备开始此过程，如文本协议中所述。在 96 孔聚苯乙烯微孔的每个孔中加入 200 微升液体介质。使用无菌施用器，采取少量的每个准备的菌落，并暂停每个殖民地在单独的井，包含液体介质。

包括一个空白井，用于板上的每一排，其中包含相同介质的 200 微升。现在，在连接到自动微孔板读取器的板读卡器检测软件上设置协议。将温度设置为 30 摄氏度，并设置 24 小时的动力学程序，读取频率为 2 分钟。

这导致每井在 24 小时内总共读取 721 次。将抖动设置为连续的快速轨道抖动。将光学读数设置为测量波长为 600 纳米的光散射，以测量光学密度，并设置从板下方读取的光。

24 小时后，记录最终的空白光学密度读数，并使用文本协议中的公式确定将每个样本稀释到 0.1 的光学密度所需的体积。要对来自每个实验井使用的稀释量进行批处理，请从板读卡器软件导出数据，并使用电子表格软件插入与函数相同的公式。每 24 小时使用与零日相同的介质，使用公式将每个样品稀释到 0.1 的光学密度。

确保使用该公式将所有孔稀释至 0.1 的光学密度。这包括可能已经开始显示其生长缺陷的恢复的油井。保存每天生成的所有增长曲线。

请注意，任何单个菌落，显示由最终光学密度判断的增长率增加，该密度明显高于具有相同遗传背景的群体的其余部分，或由与野生菌落相似的生长曲线判断。这种检测通常需要7至14天。在无菌条件下执行所有步骤。

从板读取器测定的最后一天开始，一些液体培养物的生长速度明显恢复，大概通过获得抑制剂突变来缓解父母突变的表型。为了储存表型恢复的培养物，将250微升液体培养物转移并混合到含有250微升50%甘油的低温管中。闪光冻结液氮中的细胞，并无限期地将菌株保存在零下80摄氏度。

要确认抑制器突变是遗传遗传性元素，请使用标准基因交叉方法将您最喜爱的突变P细胞与您最喜爱的突变S细胞交叉。当两个具有免费交配类型的单倍体细胞混合并遭受氮饥饿时，它们可以产生一个孢子，形成四个孢子的四分之一。父母的遗传物质将按照孟德利亚遗传学的规则在梅氏病期间分离。

孢子孢子后，来自同一四分道的单个孢子可以解剖，形成四个单独的菌落，如在盘子上垂直观察。使用微孔将孢子一个均匀地放在盘子上。解剖后，让细胞在30摄氏度的培养箱中生长几天，直到菌落出现。

如果抑制器突变是遗传遗传元素，则此十字架应产生四分，其中两个菌落具有父应变的病性表型，两个菌落具有抑制菌株的恢复增长率。从同一遗传十字架中选取三个具有抑制表型的菌落和三个具有父母表型的菌落，然后按照文本协议中详细说明的基因组DNA提取和测序步骤进行。然后进行生物信息学分析，以识别抑制器突变，详见本文。

在初始时间点记录单个菌落的生长曲线，使用板读卡器连续监测，持续监测记录了六天。正如预期的那样，野生菌落在整个实验中，其生长曲线没有明显变化。值得注意的是，四个殖民地与精灵1删除背景和一个al1删除殖民地显示增长的戏剧性转变，从缓慢增长到一些不同的增长水平，类似于野生类型殖民地。

戏剧性地，所有clr6突变体都显示，在测定结束时，表型恢复以更快的速度增长。实验室中使用站点定向突变的标准协议重建了两个识别的非同义变化，即 cue2突变和 rpl2702 突变。Cue2 elf1 双突变体和 rpl2702 elf1 双突变体与免费的 elf1 删除突变株交叉。

基因交叉表明，已识别的抑制突变成功地抑制了精灵1缺失突变的缓慢生长表型，并且具有遗传性。在96孔板的每日稀释过程中，重要的是将所有油井稀释到相同的浓度，以避免人为生长恢复。这种方法允许以高通量方式分离抑制剂突变，从而加速了数百个在裂变酵母和其他微生物中没有良好特征的基因的发现。

此方法可用于分离所有具有突变导致生长缺陷的微生物的抑制剂，这些微生物可以在液体培养中生长到大量。识别裂变酵母中的抑制剂突变可能会对在重叠通路中发现致病基因有潜在影响，尤其是当涉及到从酵母到人类高度保守的通路时。