Este protocolo descreve uma tela supressora simples e eficaz para identificar mutações supressoras em mutantes que têm um defeito de crescimento na levedura de fissão. Os métodos tradicionais de mutagênese usam produtos químicos tóxicos ou UV que podem gerar múltiplas mutações em uma célula. Por outro lado, este protocolo pode enriquecer um único mutante supressor em células individuais sem usar métodos indutores de mutação.
Inicie este procedimento com construção e preparação de tensão, conforme descrito no protocolo de texto. Adicione 200 microliters de mídia líquida a cada poço de uma microplacão de poliestireno de 96 poços. Com um aplicador estéril, pegue uma pequena quantidade de cada uma das colônias preparadas e suspenda cada colônia em poços individuais que contenham a mídia líquida.
Inclua um poço em branco para cada linha na placa contendo 200 microliters da mesma mídia. Agora configure o protocolo no software de detecção do leitor de placas conectado a um leitor automatizado de microplacões. Defina a temperatura em 30 graus Celsius e programe um programa cinético por 24 horas com frequência de leitura de dois minutos.
Isso resulta em 721 leituras totais durante um período de 24 horas por poço. Coloque o tremor em um contínuo tremor orbital rápido. Defina as leituras ópticas para medir a dispersão de luz em um comprimento de onda de 600 nanômetros para medir a densidade óptica e definir a luz para ler abaixo da placa.
Após 24 horas, registo as leituras finais de densidade óptica em branco e use a fórmula no protocolo de texto para determinar o volume necessário para diluir cada uma das amostras até uma densidade óptica de 0,1. Para processar em lote o volume de diluição a ser usado de cada poço experimental, exporte os dados do software do leitor de placas e use um software de planilha para inserir a mesma fórmula em função. A cada 24 horas, use a mesma mídia do dia zero para diluir cada uma das amostras a uma densidade óptica de 0,1 usando a fórmula.
Certifique-se de usar a fórmula para diluir todos os poços até uma densidade óptica de 0,1. Isso inclui os poços que podem ter começado a mostrar alguma recuperação em seu defeito de crescimento. Salve todas as curvas de crescimento geradas diariamente.
Note qualquer colônia individual que mostre uma taxa de crescimento aumentada julgada por uma densidade óptica final que é significativamente maior do que o resto da coorte com o mesmo fundo genético ou por uma curva de crescimento que é semelhante à das colônias do tipo selvagem. Este ensaio geralmente leva cerca de sete a 14 dias. Realize todas as etapas em condições estéreis.
Desde o último dia do ensaio do leitor de placas, algumas culturas líquidas têm uma taxa de crescimento visivelmente recuperada presumivelmente ganhando uma mutação supressora que pode aliviar o fenótipo da mutação parental. Para armazenar as culturas fenotipicamente recuperadas, transfira e misture 250 microliters de cultura líquida para um criotube contendo 250 microliters de 50% de glicerol. Flash congele as células em nitrogênio líquido e salve as cepas em menos 80 graus Celsius indefinidamente.
Para confirmar que a mutação do supressor é um elemento geneticamente herdável, use métodos de cruzamento genético padrão para cruzar suas células P mutantes favoritas com suas células mutantes favoritas. Quando duas células haploides com um tipo de acasalamento gratuito são misturadas e submetidas à fome de nitrogênio, elas podem gerar um zigoto que esporos para formar um tetrad de quatro esporos. Os materiais genéticos dos pais se segregarão durante a meiose seguindo as regras da genética mendeliana.
Após a esporulação, esporos individuais dos mesmos tetrads podem ser dissecados e formar quatro colônias individuais como observado verticalmente em uma placa. Coloque uniformemente os esporos um a um na placa usando uma microacela. Após a dissecação, deixe as células crescerem em uma incubadora de 30 graus Celsius por alguns dias até que as colônias apareçam.
Se a mutação supressora é um elemento geneticamente hereditário, esta cruz deve produzir tetrads em que duas colônias têm o fenótipo da doença da cepa parental e duas colônias têm a taxa de crescimento de recuperação da cepa supressora. Escolha três colônias com o fenótipo supressor e três colônias com o fenótipo parental da mesma cruz genética e proceda com as etapas genômicas de extração de DNA e sequenciamento, conforme detalhado no protocolo de texto. Em seguida, realize a análise bioinformática para a identificação das mutações do supressor conforme detalhado no texto.
Curvas de crescimento de colônias individuais foram registradas no ponto de tempo inicial e durante seis dias com monitoramento contínuo utilizando o leitor de placas. Como esperado, as colônias do tipo selvagem não mostram mudanças perceptíveis em suas curvas de crescimento ao longo do experimento. Notavelmente, quatro colônias com o fundo de exclusão de elfo1 e uma colônia de exclusão fal1 mostram uma mudança dramática no crescimento do crescimento lento para alguns níveis variados de crescimento semelhantes aos das colônias do tipo selvagem.
Dramaticamente, todos os mutantes clr6 mostram uma recuperação fenotípica consistente crescendo a uma velocidade mais rápida no final do ensaio. Duas das alterações não sinônimos identificadas, a mutação cue2 e a mutação rpl2702 foram reconstruídas em laboratório usando protocolos padrão para mutagênese direcionada ao local. Os mutantes duplos Cue2 Elf1 e os mutantes duplos de elfo1 rpl2702 foram cruzados com a tensão mutante de exclusão de elfo1.
A travessia genética mostrou que as mutações do supressor identificado são bem sucedidas em suprimir o fenótipo de crescimento lento do mutante de exclusão de elfo1 e são hereditárias. Durante a diluição diária da placa de 96 poços, é importante diluir todos os poços para a mesma concentração, a fim de evitar a recuperação artificial do crescimento. Este método permite o isolamento de mutações supressoras de forma elevada acelerando a descoberta de centenas de genes que não foram bem caracterizados em leveduras de fissão e outros microrganismos.
Este método pode ser usado para isolar supressores para todos os microrganismos que têm mutação causando defeito de crescimento e que podem ser cultivados para uma grande população na cultura líquida. Identificar mutações supressoras na levedura de fissão pode ter implicações potenciais na descoberta de genes causadores de doenças em vias sobrepostas, especialmente quando se trata de caminhos altamente conservados de levedura para humanos.
