Bu protokol, fisyon mayasında büyüme kusuru olan mutantlarda baskılayıcı mutasyonları tanımlamak için basit ve etkili bir bastırıcı ekranı tanımlar. Geleneksel mutagenez yöntemleri bir hücrede birden fazla mutasyon üretebilir toksik kimyasallar veya UV kullanın. Tersine, bu protokol mutasyon indükleme yöntemleri kullanmadan tek tek hücrelerde tek bir bastırıcı mutant zenginleştirebilirsiniz.
Bu yordamı metin protokolünde açıklandığı gibi gerinim yapımı ve hazırlığı ile başlayın. 96 kuyulu polistiren mikroplakanın her kuyuya 200 mikrolitre sıvı ortam ekleyin. Steril bir aplikatör ile, hazırlanan kolonilerin her biri küçük bir miktar almak ve sıvı medya içeren ayrı kuyularda her koloni askıya.
Aynı ortama ait 200 mikrolitre içeren plakadaki her satır için boş bir kuyu ekleyin. Şimdi otomatik bir mikroplaka okuyucubağlı plaka okuyucu algılama yazılımı üzerinde protokol ayarlayın. Sıcaklığı 30 santigrat dereceye ayarlayın ve iki dakikalık okuma frekansı ile 24 saat için bir kinetik program ayarlayın.
Bu sonuç, kuyu başına 24 saatlik bir süre içinde toplam 721 okur. Sürekli hızlı yörüngesal sallayarak sallayarak ayarlayın. Optik yoğunluğu ölçmek ve ışığı plakanın altından okumaya ayarlamak için ışık dağılımlarını 600 nanometre dalga boyunda ölçecek şekilde ayarlayın.
24 saat sonra, son boş optik yoğunluk okumalarını kaydedin ve her bir numuneyi 0,1 optik yoğunluğa düşürmek için gereken hacmi belirlemek için formülü metin protokolünde kullanın. Her deney kuyusunun kullanılacak seyreltme hacmini toplu olarak işlemek için, plaka okuyucu yazılımından verileri dışa aktarın ve işlevle aynı formülü eklemek için bir elektronik tablo yazılımı kullanın. Her 24 saatte bir, formülü kullanarak her numuneyi 0,1 optik yoğunluğa seyreltmek için sıfır günüyle aynı ortamı kullanın.
Tüm kuyuları 0,1 optik yoğunluğa düşürmek için formülü kullandığınızdan emin olun. Bu onların büyüme defekti bazı iyileşme gösteren başlamış olabilir kuyuları içerir. Günlük olarak oluşturulan tüm büyüme eğrilerini kaydedin.
Aynı genetik geçmişe sahip kohortun geri kalanından veya yabani tip kolonilere benzer bir büyüme eğrisiile önemli ölçüde daha yüksek olan son optik yoğunluktarafından değerlendirilen büyüme hızının arttığını gösteren herhangi bir koloniye dikkat edin. Bu titregenellikle yaklaşık yedi ila 14 gün sürer. Steril koşullar altında tüm adımları gerçekleştirin.
Plaka okuyucu tamsasının son gününden itibaren, bazı sıvı kültürlerde muhtemelen ebeveyn mutasyonunun fenotipini hafifletebilecek bir bastırıcı mutasyon kazanarak belirgin bir şekilde iyileşmiş bir büyüme hızıvardır. Fenotipik olarak kurtarılan kültürleri depolamak için 250 mikrolitre sıvı kültürü, %50 gliserol 250 mikrolitre içeren bir kriyotube aktarın ve karıştırın. Flaş sıvı nitrojen hücreleri dondurmak ve eksi 80 santigrat derece süresiz suşları kaydedin.
Bastırıcı mutasyongenetik olarak kalıtsal bir unsur olduğunu doğrulamak için, favori mutant S hücreleri ile favori mutant P hücreleri çapraz standart genetik geçiş yöntemleri kullanın. Ücretsiz çiftleşme türüne sahip iki haploid hücre karıştırılıp azot açlığı yla karşı karşıya kaldığında, dört spordan oluşan bir tetra oluşturmak için spor yapan bir zigot üretebilirler. Ebeveyn genetik materyalleri, mendelian genetiğin kurallarına göre meyozis sırasında ayrılacaktır.
Sporlaşmadan sonra, aynı tetradlardan gelen tek tek sporlar kesilebilir ve bir plaka üzerinde dikey olarak gözlenen dört ayrı koloni oluşturabilir. Sporları mikroiğne kullanarak teker teker tabağa eşit olarak yerleştirin. Diseksiyondan sonra, koloniler ortaya çıkana kadar hücreleri 30 santigrat derecelik bir kuluçka makinesinde birkaç gün büyümeye bırakın.
Eğer bastırıcı mutasyon genetik olarak kalıtsal bir elementse, bu haç iki koloninin ebeveyn suşunun hastalık fenotitipine sahip olduğu tetrads ve iki koloni nin bastırıcı suş iyileşme büyüme hızına sahip olması gerekir. Bastırıcı fenotip ile üç koloni ve aynı genetik haç ebeveyn fenotip ile üç koloniler seçin ve metin protokolünde ayrıntılı olarak genomik DNA çıkarma ve sıralama adımları ile devam edin. Daha sonra metinde ayrıntılı olarak bastırıcı mutasyonların belirlenmesi için biyoinformatik analizi gerçekleştirin.
Tek tek kolonilerin büyüme eğrileri ilk zaman noktasında ve plaka okuyucu kullanılarak sürekli izleme ile altı gün boyunca kaydedildi. Beklendiği gibi, vahşi tip koloniler deney boyunca büyüme eğrilerinde gözle görülür bir değişiklik göstermezler. Özellikle, elf1 silme arka plan ve bir fal1 silme kolonisi ile dört koloniler yavaş büyüyen büyüme den büyüme bazı değişen düzeylerde vahşi türü kolonilerin benzer büyüme dramatik bir değişim göstermektedir.
Dramatik, tüm clr6 mutantlar tutarlı bir phenotipic kurtarma daha hızlı bir oranda tsay sonunda büyüyen göstermektedir. Tanımlanan eş anlamlı olmayan değişikliklerden ikisi, cue2 mutasyonu ve rpl2702 mutasyonu laboratuvarda site yönelimli mutagenez için standart protokoller kullanılarak yeniden oluşturuldu. Cue2 elf1 çift mutantlar ve rpl2702 elf1 çift mutantlar ücretsiz elf1 silme mutant zorlanma ile geçti.
Genetik geçiş, tanımlanan baskılayıcı mutasyonların elf1 silme mutantının yavaş büyüyen fenotipini bastırmada başarılı olduğunu ve kalıtsal olduğunu göstermiştir. 96-iyi plaka günlük seyreltme sırasında, yapay büyüme kurtarma önlemek için aynı konsantrasyontüm kuyuları seyreltmek için önemlidir. Bu yöntem, baskılayıcı mutasyonların yüksek iş gücü yle izole edilmesine olanak sağlar ve fisyon mayası ve diğer mikroorganizmalarda iyi karakterize edilmemiş yüzlerce genin keşfini hızlandırır.
Bu yöntem, büyüme kusuruna neden olan mutasyona neden olan ve sıvı kültürde büyük bir popülasyona yetiştirilen tüm mikroorganizmalar için bastırıcıları izole etmek için kullanılabilir. Fizyonmaya kadar çok korunmuş yollar söz konusu olduğunda, fisyon mayasında baskılayıcı mutasyonların belirlenmesi, özellikle de mayadan insanlara kadar yüksek derecede korunmuş yollar söz konusu olduğunda, çakışan yollarda hastalığa neden olan genlerin bulunmasında potansiyel sonuçlar doğurabilir.
