我们开发了一种高通量的测定方法，用于测量嗜中性粒细胞外陷阱（NETs）。NET 是由嗜中性粒细胞暴露的免疫原 DNA 结构。内毒可以捕获和杀死微生物，因此是一种重要的抗感染机制，但它们在自身免疫性疾病中也起着致病作用。
利用这项技术，通过三维免疫荧光共合显微镜对NET进行量化，从而形成一种高度敏感和高通量的方法，研究NET的形成和降解。这项技术使我们能够量化自身免疫性疾病患者的NET形成。可通过此检测监测与 ANCA 相关的血管炎或全身性红斑狼疮患者体内网络形成。
此外，针对NET形成的潜在治疗可以通过体外检测进行测试。对于以前从未执行过这种技术的人来说，嗜中性粒细胞分离可能是一场斗争。要开始这个程序，从两个10毫升EDTA编码管的健康供体获得20毫升的外周血。
将无菌 50 毫升管和 PBS 中的 10 毫升血液转移到最终总体积 32.5 毫升。使用 10 毫升移液器和移液器控制器，可测量 14 毫升的密度梯度。将移液器放在 50 毫升管的底部。
然后，将移液器控制器从移液器上移下来，允许密度梯度通过重力流出，直到毛细管效应达到最大值。将拇指放在移液器顶部，以防止剩余密度梯度泄漏出来，然后从管子上取下移液器。在室温下以 912 倍 g 离心管 20 分钟，无需加速或制动。
先小心地取出含有外周血单核细胞的白环，然后进行PBS稀释的血浆。最后，尽可能删除密度梯度图层。接下来，从冰箱中取出一瓶冷无菌蒸馏水和一瓶10倍浓缩PBS的烧瓶。
快速工作，将36毫升的水直接加到颗粒上，并仔细混合一次。从开始计算 20 秒后，加入 4 毫升 10 倍 PBS，即可制造同位素溶液。再次，仔细混合一次。
将管在739倍g和4摄氏度下离心5分钟。丢弃上清液，确保非常小心，因为颗粒不固体，并迅速重复添加冷无菌蒸馏水和浓缩PBS的过程，如前面所述。在328倍g和4摄氏度的离心机5分钟。
小心地去除上一杯，将颗粒重新悬浮在五毫升 PBS 中。数一数嗜中性粒细胞，并把它们放在冰上。首先，在15毫升管中，在PBS的两毫升中制造含有约1000万至2000万微粒粒中性粒细胞的中性粒细胞悬浮液。
在不同的15毫升管中，将两毫升PBS与四微升的两微摩尔红荧光细胞链接器混合。轻轻地将红色荧光细胞链接器溶液加入嗜中性粒细胞悬浮液中，并仔细混合。用铝箔包裹管子，保护混合物免受光，并在37摄氏度下孵育25分钟，用红色荧光细胞链接器标记中性粒细胞。
通过将含有 10% 热灭活 FCS 的 RPMI 1640 介质添加到 15 毫升的最终体积中，并仔细混合一次，使标签灭活。如果在此之后形成颗粒，请小心地重新悬浮混合物。在室温下以328倍g离心管5分钟。
在去除上一液之前，确保颗粒已经形成。在此之后，在室温下将颗粒重新悬浮在含有 2%FCS 的 5 毫升无红色 RPMI 1640 介质中。然后，数一数嗜中性粒细胞。
在含有2%FCS的苯酚无红RPMI 1640介质中，以每毫升42万个细胞的密度进行细胞悬浮。在90微升中加入37，500个中性粒细胞，每井的黑色96井，平底板。接下来，在三升中加入10微升所选刺激，每井浓度达到10%。
始终在三次中包含负控件。在黑暗中孵育37摄氏度，时间从30分钟到2、4或6小时不等。然后，准备加入25微升5微摩尔不渗透DNA染料所需的不渗透DNA染料的体积，以达到每井中1微摩尔的最终浓度。
在孵化时间结束前15分钟，在每井中加入25微升的5微摩尔不渗透DNA染料。继续潜伏，在黑暗中37摄氏度的37度下进行最后15分钟的孵化。在此之后，请非常小心地取出上一液，并根据需要进行存储。
加入100微升4%的甲醛。将板保持黑暗，并立即进入下一节。配置设置后，选择 Z 系列。
选择 10 作为步骤数。选择三微米作为步长。将板装入免疫荧光共性显微镜。
单击"运行"选项卡。填写板名和说明，并选择存储位置。选择需要获取的油井。
选择德州红和 FITC 的曝光时间。然后，单击"获取板"并开始采集，这大约需要每板一个小时。在此之后，选择"分析宏"。
然后选择 w1，然后选择阈值。接下来，选择所需的像素值。最后，在第二个图像 J 窗口中，选择 w2，然后选择具有所需像素值的阈值。
选择电子表格文件的目标，运行分析，然后保存日志文件。这里介绍的是一个高度敏感的广泛适用的测定，用于对中性粒细胞外陷阱形成的半自动定量，用于评估中性粒细胞外诱捕对不同刺激物的外体诱导。NET形成以三维方式进行量化，通过量化超过10个Z堆栈的染色细胞外DNA，从每井的焦平面开始，距离为3微米。
通过测量累积面积，测定的灵敏度增加。成像的染色中性粒细胞的总面积仅在每一井的焦平面上进行量化，该焦平面与每一井的总中性粒细胞计数显著相关，皮尔逊相关系数为 0.99。中性粒细胞中NET形成定量的代表性结果表示为每图的中性粒细胞超过10个Z堆栈的累积染色细胞外DNA区域。
然后拍摄净定量测定的快照。此处显示了未刺激的嗜中性粒细胞和 AAV 刺激的嗜中性粒细胞的具有代表性的图像，其中荧光标记的中性粒细胞为红色，彩色细胞外 DNA 为绿色。应谨慎处理嗜中性粒细胞，并完全按照协议执行 PKH 标记。
这种测定可用于研究NETs的形态学、动力学和组成。这项技术是另一种提供研究健康和疾病的NET的可能性的方法。Trypan 蓝色、PKH 和 PFA 应用手套处理，不应直接吸气。
