Мы разработали высокотемпутный анализ для измерения нейтрофиловых внеклеточных ловушек, или NETs. NETs являются иммуногенными структурами ДНК, которые подвергаются воздействию нейтрофилов. NETs может ловить и убивать микроорганизмы и, следовательно, является важным антиинфекционным механизмом, но они также играют патогенную роль при аутоиммунных заболеваниях.
С помощью этого метода, NETs количественно трехмерных иммунофторесценции конфокарной микроскопии в результате чего весьма чувствительны и высокой пропускной метод для изучения NET формирования и деградации. Этот метод позволяет количественно NET формирования пациентов с аутоиммунными заболеваниями. Ex vivo NET формирования пациентов с ANCA связанных васкулит или системной волчанки эритематоз может контролироваться с помощью этого анализа.
Кроме того, потенциальные терапевтические ориентации NET формирования могут быть проверены с помощью этого анализа в пробирке. Нейтрофиловая изоляция может быть борьбой для людей, которые никогда не выполняли эту технику раньше. Чтобы начать эту процедуру, получить 20 миллилитров периферической крови от здорового донора в двух 10-миллилитровых EDTA-кодовых труб.
Передача 10 миллилитров крови в стерильной 50-миллилитровой трубке и PBS в окончательный общий объем 32,5 миллилитров. Используя 10-миллилитровую пипету и контроллер пипетки, возьмите 14 миллилитров градиента плотности. Поместите пипетку на дно 50-миллилитровой трубки.
Затем свясть контроллер пипетки с пипетки, позволяя градиенту плотности вытекать под действием силы тяжести до тех пор, пока максимум не будет достигнут капиллярного эффекта. Поместите большой палец на верхней части пипетки, чтобы предотвратить оставшуюся плотность градиента от утечки, а затем удалить пипетку из трубки. Центрифуга трубки при 912 раз г при комнатной температуре в течение 20 минут без ускорения или торможения.
Тщательно удалите белое кольцо, содержащее периферические моноядерные клетки крови во-первых, после PBS разбавленной плазмы. Наконец, удалите слой градиента плотности как можно больше. Затем извлечения бутылки холодной стерильной дистиллированной воды и колбы 10x концентрированной PBS из холодильника.
Работая быстро, добавьте 36 миллилитров воды прямо поверх гранул и тщательно перемешайте один раз. После 20 секунд, подсчитанных с самого начала, добавьте четыре миллилитров 10x PBS, чтобы сделать изотоническое решение. И снова, смешать один раз тщательно.
Центрифуга трубки в 739 раз г и при четырех градусах по Цельсию в течение пяти минут. Откажитесь от супернатанта, убедившись, что быть очень осторожным, как гранулы не является твердой, и быстро повторить процесс добавления холодной стерильной дистиллированной воды и концентрированной PBS, как описано ранее. Центрифуга при 328 градусах г и четыре градуса по Цельсию в течение пяти минут.
Аккуратно удалите супернатант и повторно приостановите гранулы в пяти миллилитров PBS. Подсчитайте нейтрофилов и держите их на льду. Во-первых, сделать нейтрофиловую суспензию, содержащую примерно от 10 до 20 миллионов нейтрофилов в двух миллилитров PBS в 15-миллилитровой трубке.
В другой 15-миллилитровой трубке смешайте два миллилитров PBS с четырьмя микролитров двухмимолярного красного флуоресцентного сотового связующим звена. Аккуратно добавьте красный флуоресцентный клеточный связующий раствор к подвеске нейтрофила и тщательно перемешайте. Оберните трубку в алюминиевую фольгу, чтобы защитить смесь от света, и инкубировать в течение ровно 25 минут при 37 градусах по Цельсию, чтобы обозначить нейтрофилов красным флуоресцентным связующим звеном клеток.
Инактивировать маркировку, добавив RPMI 1640 среды, содержащей 10% тепла инактивированных FCS при комнатной температуре до конечного объема 15 миллилитров и перемешать один раз тщательно. Если после этого гранулы сформировались, тщательно повторно приостановить смесь. Центрифуга трубки при 328 раз г при комнатной температуре в течение пяти минут.
Перед удалением супернатанта убедитесь, что гранулы образовались. После этого повторно приостанавливайте гранулы в пяти миллилитров красно-свободной RPMI 1640 среды, содержащей 2%FCS при комнатной температуре. Затем посчитайте нейтрофилов.
Сделайте подвеску клетки при плотности 420 000 клеток на миллилитр в phenol red-free RPMI 1640 среды, содержащей 2%FCS. Добавьте 37 500 нейтрофилов в 90 микролитров к каждому колодецу из черной пластины с плоским дном 96-колодец. Далее добавьте 10 микролитров выбранного стимула в тройном для достижения концентрации 10% в каждой колодец.
Всегда включаю отрицательный контроль в тройном. Инкубировать в темноте при 37 градусах по Цельсию в течение нужного времени, в диапазоне от 30 минут до двух, четырех или шести часов. Затем подготовь объем непроницаемого красителя ДНК, необходимый для добавления 25 микролитров пятимимолярного непроницаемого красителя ДНК, чтобы достичь конечной концентрации одного микромолара в каждой колодец.
За 15 минут до окончания инкубации добавьте в каждую колодец 25 микролитров пятимиллярного непроницаемого красителя ДНК. Продолжить инкубацию в течение последних 15 минут при 37 градусах по Цельсию в темноте. После этого, удалить супернатант очень тщательно и хранить, если это необходимо.
Добавьте 100 микролитров 4%paraformaldehyde. Держите тарелку в темноте, и немедленно перейти к следующему разделу. После настройки настроек выберите серию «Я».
Выберите 10 в качестве количества шагов. Выберите три микрометра в качестве размера шага. Загрузите пластину в иммунофлюоресценцию конфокального микроскопа.
Нажмите на вкладку Run. Заполните имя и описание таблички и выберите место хранения. Выберите скважины, которые необходимо приобрести.
Выберите время экспозиции для Texas Red и FITC. Затем нажмите на Acquire Plate и начните приобретение, которое займет около одного часа за тарелку. После этого выберите Анализ Макро.
Затем выберите w1 и выберите пороговое значение. Далее выберите желаемое значение пикселя. И, наконец, во втором окне Image J выберите w2 и выберите пороговое значение с желаемым значением пикселя.
Выберите пункт назначения для файла электронной таблицы, запустите анализ и сохраните файл журнала после этого. Представлено здесь очень чувствительный широко применимый анализ для полуавтоматической количественной оценки нейтрофиловой внеклеточной формирования ловушки для оценки индукции ex vivo внеклеточных ловушек нейтрофила на различных стимулах. Формирование NET количественно в трехмерной манере путем количественной оценки окрашенных внеклеточной ДНК более 10 -стеков с трехмиметровым расстоянием, начиная с фокусной плоскости в каждой хорошо.
Измеряя кумулятивную область, чувствительность анализа увеличивается. Общая площадь окрашенных нейтрофилов, изображенных, количественно измеряется только в фокусной плоскости в каждой хорошо, которая значительно коррелирует с общим числом нейтрофилов в каждой колодец с коэффициентом корреляции Пирсона 0,99. Репрезентативный результат количественной оценки образования NET в нейтрофилах выражается как кумулятивная окрашенная внеклеточная область ДНК более 10 стеков на изображенный нейтрофил.
Затем снимки взяты из анализа чистой количественной оценки. Репрезентативные изображения нестимулированных нейтрофилов и NETs в ААВ-стимулированных нейтрофилов показаны здесь с флуоресцентными метками нейтрофилов в красном и окрашенных внеклеточной ДНК в зеленом цвете. Нейтрофилы должны обрабатываться с осторожностью, а маркировка PKH должна выполняться точно в соответствии с протоколом.
Этот анализ может быть использован для изучения морфологии, кинетики и состава NETs. Этот метод является еще одним методом, который предоставляет возможность для изучения NETs в области здравоохранения и болезней. Трипан синий, PKH, и PFA должны быть обработаны с перчатками и не должны быть вдохнул непосредственно.
