小鼠鳞状细胞细胞的肿瘤免疫分析及治疗反应评价

头颈部的癌症正变得越来越普遍。然而，对肿瘤微环境以及该区域治疗阻力机制的了解有限。该技术可用于以易于访问的方式重新概括头部/颈部肿瘤的原生微环境，并产生类似于人类的临床表现。

当肿瘤细胞培养达到70%的汇合时，每次洗涤用冷PBS洗三次细胞，并附着细胞足够的0.25%胰腺素覆盖培养瓶的底部表面。在细胞培养箱中3至4分钟后，在光学显微镜下确认分离，用12毫升DMEM F12培养基中中和胰蛋白石，辅以胎儿牛血清。将细胞悬浮液转移到50毫升锥形管中，通过反转将细胞混合三到四次。

然后通过离心收集细胞，并在血清中重新悬浮颗粒和不含抗生素的DMEM，每50微升中浓度在冰上的10至第六个肿瘤细胞。注射前，将细胞混合在一对一肿瘤细胞悬浮到冰基膜基质比。加载一个0.5毫升注射器，配备23规格的针头，每个受助动物有100微升的细胞。

将注射器放在冰上，并确认麻醉小鼠对手趾捏缺乏反应。接下来，通过口腔两侧的可用开放空间将针头插入右侧或左侧的球状区域，使注射器与水桶区域平行，同时在口腔内，从而在五秒钟内注射细胞基底基质悬浮液的 100 微升完全体积。将注射器保持到位五秒钟，以确保在轻轻提取注射器之前已注射所有材料。

肿瘤将在大约一个星期内变得严重可见。注射一周后，使用卡钳测量每个肿瘤的长度和宽度，确定肿瘤体积每周一到两次。并测量每种动物的重量，以评估肿瘤生长对喂养的影响。

在适当的实验终点点，使用锋利的剪刀和钝钳，使皮肤切口通过颈部的中线。将剪刀轻轻插入覆盖肿瘤的皮肤下，通过将剪刀推过皮肤并推入皮肤，从而产生气囊。一旦皮肤与肿瘤充分分离，切除排出的淋巴结，以避免肿瘤组织被淋巴组织的存在混淆，并穿过肿瘤的边界，直到整个体积分离。

要处理肿瘤进行下游分析，将肿瘤切成一到两毫米大小的片段，然后放入含有胶原酶三、DNA一和胰蛋白酶抑制剂的50毫升锥形管中。在37摄氏度下孵育肿瘤片30分钟后，每10分钟摇动一次，将20毫升的HSS加入管子，并通过70微米倒尼龙过滤器将含有肿瘤片段的悬浮液通过。使用五毫升注射器柱塞捣碎过滤器中的肿瘤片段，并通过过滤器添加额外的 10 毫升 HBSS。

通过离心向下旋转细胞。用严格的移液将颗粒重新悬浮在2至3毫升红细胞解液缓冲液中，在室温下两分钟后用20毫升新鲜HBSS中和。然后将细胞重新悬浮在另外20毫升的HSSS中，进行另一次离心，并通过40微米浇注过滤器对细胞进行应变，以清除肿瘤细胞悬浮液中的任何最终碎屑。

与 B4B8 肿瘤相比，LY2 肿瘤的生长速度更高。由于吞咽困难，出现下颚位移的小鼠体重迅速减轻。LY2小鼠的中位存活率也低于B4B8肿瘤小鼠的一半。

肿瘤小鼠的磁共振成像显示，有良好划分的肿瘤延伸到水桶粘膜的内层，而不是到舌头或其他附近的器官。组织学检查表明，所有LY2肿瘤承载小鼠发育分化不良的鳞状细胞癌，而携带B4B8肿瘤的小鼠发展中度分化鳞状细胞癌。所有LY2肿瘤轴承小鼠也有组织学确认坏死，其中大多数表现出中度至重度坏死。

在这个具有代表性的实验中，一个LY2肿瘤在水桶区肿瘤细胞注射三周后被收获和处理，如证明。CD45阳性免疫细胞占肿瘤细胞总数的7.3%。CD11b阳性骨髓细胞占CD45阳性细胞的37.8%，其中大多数被确定为F480-阳性巨噬细胞，小微粒细胞和骨髓源抑制细胞也观察到。

T细胞占CD45阳性免疫细胞总数的15.9%，其中53.4%为CD4阳性FoxP3阳性调节T细胞。自然杀伤细胞占所有CD45阳性细胞的不到2%。重要的是要练习注射，以培养信心和舒适，在举行针和接受者鼠标和暴露动物的嘴。

一旦手术成功，可以进行包括评估肿瘤对治疗的反应或评估肿瘤内在和微环境因素的实验。这项技术为设计一项由调查人员发起的临床试验铺平了道路，评估了将放射治疗与抗PL1疗法相结合对头部和颈部癌症患者的影响。