סרטן של אזור הראש והצוואר הופכים נפוצים יותר ויותר. עם זאת, יש הבנה מוגבלת של microenvironment הגידול ואת המנגנונים של עמידות לטיפול באזור זה. טכניקה זו יכולה לשמש כדי לסכם מחדש את microenvironment המקומי של גידולים בראש / צוואר באופן נגיש ומייצר ביטויים קליניים דומים לאלה שנראו בבני אדם.
כאשר תרבות התאים הגידול הגיע 70%confluency, לשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS קר לכל לשטוף ולצרף את התאים עם מספיק 0.25% טריפסין כדי לכסות את המשטח התחתון של בקבוק התרבות. לאחר שלוש עד ארבע דקות באינקובטור תרבות התא, לאשר ניתוק תחת מיקרוסקופ אור ולנטרל את טריפסין עם 12 מיליליטר של אמצעי DMEM F12, בתוספת סרום חזיר עוברי. מעבירים את ההשעיה התא לתוך צינור חרוט 50 מיליליטר ומערבבים את התאים שלוש עד ארבע פעמים על ידי היפוך.
ואז לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה מחדש להשעות את גלולה בסרום ו DMEM ללא אנטיביוטיקה באחת פעמים 10 לתאי הגידול השישי לכל 50 microliters של ריכוז בינוני על הקרח. מיד לפני ההזרקה, מערבבים את התאים בהשעיית תאים סרטניים אחד לאחד ליחס מטריצת קרום מרתף על קרח. לטעון מזרק אחד 0.5 מיליליטר מצויד מחט 23-מד עם 100 microliters של תאים לכל בעל חיים הנמען.
מניחים את המזרקים על קרח ומאשרים חוסר תגובה לצביטת בוהן בעכבר הרדמה. לאחר מכן, להכניס את המחט לתוך אזור buccal ימין או שמאל דרך השטח הפתוח הזמין משני צדי הפה שמירה על המזרק במקביל לאזור buccal בזמן שהוא בתוך חלל הפה כדי להקל על הזרקה של נפח 100 microliter מלא של ההשעיה מטריצת קרום מרתף התא על פני תקופה של חמש שניות. שמור את המזרק במקום במשך חמש שניות נוספות כדי להבטיח שכל החומר הוזרק לפני משיכת המזרק בעדינות.
הגידולים יהיו גלויים בגסות בעוד כשבוע. שבוע לאחר ההזרקה, השתמש calipers כדי למדוד את האורך והרוחב של כל גידול כדי לקבוע את נפח הגידול פעם עד פעמיים בשבוע. ולמדוד את המשקל של כל בעל חיים כדי להעריך את ההשפעות של הגידול על האכלה.
בנקודת הקצה הניסיונית המתאימה, השתמש במספריים חדים ומדפים קהים כדי לבצע חתך בעור דרך קו האמצע בצוואר. ולהכניס את המספריים בעדינות מתחת לעור המכסה את הגידול כדי ליצור כיסי אוויר על ידי דחיפת המספריים לרוחב ולתוך העור. ברגע שהעור מנותק מספיק מהגידול, בלו את בלוטות הלימפה המתנקזות כדי למנוע את רקמת הגידול מבולבלת על ידי נוכחות של רקמת הלימפה לחתוך דרך גבולות הגידול עד נפח כולו מנותק.
כדי לעבד את הגידול לניתוח במורד הזרם, לחתוך את הגידול לחתיכות בגודל 1 עד 2 מילימטר ולמקום את החלקים לתוך צינור חרוט 50 מיליליטר המכיל קולגן שלוש, DNAs אחד, מעכב טריפסין. לאחר דגירה חתיכות הגידול ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות, עם רועד כל 10 דקות, להוסיף 20 מיליליטר של HBSS לצינור ולהעביר את ההשעיה המכילה את חתיכות הגידול דרך מסננת ניילון לשפוך 70 מיקרומטר. השתמש בוכנה מזרק חמישה מיליליטר כדי לרסק את חתיכות הגידול מסננת ולהוסיף 10 מיליליטר נוספים של HBSS דרך מסננת.
סובב את התאים על ידי צנטריפוגה. להשעות מחדש את גלולה לשניים עד שלושה מיליליטר של חיץ תות דם אדום עם צינורות קפדניים, נטרול תזה עם 20 מיליליטר של HBSS טרי לאחר שתי דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן להשעות מחדש את התאים ב 20 מיליליטר נוספים של HBSS עבור צנטריפוגה נוספת מאמץ את התאים באמצעות מסנן לשפוך 40 מיקרומטר כדי להסיר את כל הפסולת הסופית מן ההשעיה תא הגידול.
גידולים LY2 לגדול בקצב גבוה יותר, לעומת גידולים B4B8. ועכברים המציגים עקירת לסת במהירות לפתח ירידה במשקל, עקב דיספאגיה. ההישרדות החציונית בעכברים LY2 הוא גם פחות ממחצית שנצפה עבור עכברים נושאי גידול B4B8.
הדמיית תהודה מגנטית של עכברים נושאי גידולים מראה גידולים המסומן היטב המשתרעים לשכבה הפנימית של רירית הבוקל, אך לא ללשון או לאיברים סמוכים אחרים. בדיקה היסטולוגית עולה כי כל העכברים נושאי הגידול LY2 לפתח קרצינומה של תאים קשקשיים מובחנים היטב, בעוד עכברים הנושאים גידולי B4B8 לפתח קרצינומה של תאים קשקשיים מובחנים בינונית. כל העכברים נושאי הגידול LY2 יש גם נמק אישר היסטולוגית, עם הרוב מדגים נמק בינוני עד חמור.
בניסוי מייצג זה, גידול LY2 נקצר ומעובד שלושה שבועות לאחר הזרקת תא הגידול באזור buccal, כפי שהוכח. תאים חיסוניים חיוביים CD45 ייצגו 7.3% מכלל אוכלוסיית תאי הגידול. תאים מיאלואידיים חיוביים CD11b ייצגו 37.8% מכל התאים החיוביים CD45, שרובם נקבעו להיות מקרופאגים חיוביים F480, עם אוכלוסיות קטנות של נויטרופילים ותאי מדכא שמקורם במיאלואידים נצפו גם.
תאי T היוו 15.9% מאוכלוסיית תאי החיסון החיוביים ל-CD45, 53.4% מהם היו תאי T רגולטוריים חיוביים ל-CD4. תאים קטלניים טבעיים היוו פחות מ-2% מכלל התאים החיוביים ל-CD45. חשוב לתרגל הזרקה על מנת לפתח ביטחון ונוחות בהחזקת המחט והעכבר המטופל ובחשיפת הפה של החיה.
לאחר שההליך בוצע בהצלחה, ניתן לבצע ניסויים הכוללים הערכה של תגובת הגידול לטיפול או הערכה של הגורמים המהותיים והמיקרו-וירוסים של הגידול. טכניקה זו סללה את הדרך בתכנון ניסוי קליני ביוזמת חוקר, הערכת ההשפעות של שילוב הקרנות עם טיפול אנטי PL1 בחולים בסרטן הראש והצוואר.
