用于可重复模式形成的混合凝胶立方体器件中的初始三维单元群集控制

该协议使用一种简单的方法来提高3D细胞培养模型的可靠性，而无需使用任何特殊设备。该技术的主要优点是，通过控制立方设备内的初始培养条件，可以进行可重复的三D培养实验。准备五分之五毫米聚碳酸酯立方框架后，将框架放在预冷却的幻灯片和冰盒上，并使用移液器将 12 微升预热 1.5% 的 agarose 从立方框架的顶部添加到底部表面。

摊开加糖以获得平坦的表面，并允许聚合物固化。使用钳子将框架滑到玻璃的边缘并旋转框架，使打开的一侧朝下，然后再将框架放回幻灯片上。如刚刚演示的，在框架的两个表面填充更多的加糖后，将气糖从开放面放入容器中，在第四面和第五面形成一个加糖墙。

设置初始细胞簇状，将感兴趣的细胞培养基体注入适当的细胞外基质，并设置在立方体上制造微模。然后在37摄氏度下将立方体放在二氧化碳培养箱中25分钟。当细胞外基质固化时，小心地提起微模，使基质不会变质。

在细胞外矩阵中，将制作所需模具形状的口袋。将细胞在离心后浓缩到适当的实验细胞培养基中，将细胞注入细胞外基质的口袋。将立方体放入二氧化碳培养箱20分钟，温度为37摄氏度，使细胞落入细胞外基质口袋，填充微模产生的空间。

在孵化结束时，将立方体放入24井板的一个井中，并在井中加入100微升合适的细胞培养培养。注入额外的细胞外基质以关闭口袋，将立方体返回到培养箱 25 分钟。当细胞外基质固化时，在37摄氏度下将大约10微升20摄氏度的阿加罗斯滴到立方体的顶面上，以关闭表面并固化下降10至20分钟。

然后用新鲜的介质覆盖整个立方体，促进渗透压力，促进营养转移到立方体内的细胞。对于通过多向观察进行非侵入性 3D 形状识别，请将板放在显微镜舞台上，通过明亮的场或相位对比度显微镜获取立方体各侧的图像，使用钳子旋转要在捕获之间拍摄的立方体服务。通过多向观察进行免疫荧光成像，首先从含有立方体的井中吸出上流液，并在室温下将立方体固定为4%的甲状甲醛20分钟。

在固定结束时，用 PBS 清洗立方体两次，每次洗涤 10 分钟。用0.5%三吨x-100和PBS在4摄氏度下用10分钟对立方体进行渗透。接下来，每次洗涤用PBS清洗立方体三次，10分钟，然后阻止任何非特异性与山羊血清和免疫荧光缓冲液结合60分钟室温。

然后根据标准抗体染色方案，用适当的原抗体染色细胞。然后在激光或荧光显微镜上成像立方体的所有六面，正如刚刚演示的。在这个具有代表性的实验中，用正常人支气管上皮细胞培养的混合凝胶立方体的多向成像，通过相位对比度和培养物的免疫荧光成像，展示了初始圆柱形或棱镜状细胞培养的生成。

在这里，正常人类上皮细胞的免疫染色最初控制在混合凝胶立方体的圆柱形形状，后代支气管树显示。这些分支演示了垂直于圆柱轴，多维成像显示。将高密度细胞注入细胞外基质口袋非常重要，因为低密度的细胞可能导致孵化后细胞质量恶化。

该方法模式是三维细胞模式的可重复形成，通过多向成像进行定量测量，研究菜的发育机理。