这种方法可以帮助回答生产母乳寡糖所涉及的几个关键问题。首先，我有多少产品？其次，具体的碳水化合物联系是什么？
这里的目标是简化和加快这些母乳寡糖的量化和特征化过程。与目前的技术状态相比，此方法有两个优点。首先，它支持高吞吐量筛选。
所以，你可以想像在一天使用这种技术测试数千种不同的条件，甚至可能是一个合成酶库。此外，它利用自然在酶中进化的独特基质特异性，为我们提供有关这些寡糖的碳水化合物链接的信息。我们相信，这种方法可以改善母乳寡糖的生产，进而能产生更优质的婴儿配方奶粉，更密切地模仿母乳，有助于缩小母乳喂养和配方奶喂养的婴儿之间的差距。
在根据成本、吞吐量和设备可用性决定使用哪种方法去除乳糖时，建议用户自行决定。应注意确保最佳的乳糖去除。实验前一天，使用无菌技术，用卡那霉素和卡贝尼西林补充了5毫升的LB介质。
在37摄氏度的温度下孵育所有培养物。第二天，将50微升的隔夜培养剂转移到5毫升的新鲜LB M9介质中，用卡那霉素和卡贝尼西林。在37摄氏度下孵育，持续摇晃，直到培养达到OD600之间零点5和零点7。
首先，将隔夜培养物转移到一点五毫升管中，以12，500次g离心，一分钟。丢弃上一提液，在 500 微升 1x PBS 中重新悬浮颗粒，以准备单个电池悬浮液。将单单元悬架传输到传真管。
使用流量细胞计激发GP并收集文本协议中概述的 FITC 荧光水平。要制定校准曲线，在每升零到 2500 毫克的范围内对标准 2'FL 进行 8 到 10 次稀释。培养2'FL生物传感细胞，并诱导它们与标准稀释，如文本协议中概述。
在五毫升 LB 介质中启动 2'FL 产生菌株的培养，并在 37 摄氏度下一夜之间生长。第二天，亚培养在1%在250毫升准备的最小介质和添加甘油到每升10克的最终浓度。在37摄氏度下孵育，直到培养达到，OD600在零点5和零点7之间。
然后将IPTG加入到零点五毫摩尔和乳糖的最终浓度中，最终浓度为每升2克。在37摄氏度下孵育，连续摇晃24小时。第二天，将隔夜培养转移到无菌的50毫升管和离心机在900倍g15分钟。
丢弃上一杯，将颗粒重新悬浮在去压水中。重复此洗涤三次，以去除任何残留乳糖。在此之后，将颗粒重新悬浮在五毫升的去化水中。
将细胞放在冰上，在30秒脉冲中以30%的功率使用声波器来使细胞悬浮液。将 2，000 次 g 的细胞离心 25 分钟。取出上清液，并通过无菌过滤器。
将过滤的上清液存放在摄氏四度，直到准备好进行分析。接下来，接种2'FL生物传感细胞的培养物。在中日志阶段，诱导细胞与细胞的细胞以相当于用于进行校准曲线的2'FL的浓度。
执行文本协议中概述的校准。在此之后，在流式测速仪上运行样本。通过绘制荧光输出与寡糖浓度并比较标准与细胞酸盐的响应，生成剂量响应曲线。
首先，将FLαlyzedβ乳酸酶溶解到每毫升1000个单位，在一毫摩尔氯化镁中。为了确定所需的酶的最佳浓度，生长2'FL生物感应细胞的 inolum，并在中日志阶段，诱导乳糖和2'FL。到 100 微升培养物，添加可变数量的β乳糖酶，最多 12 个单位。
让文化在37摄氏度下一夜之间随着持续摇晃而生长。测量文本协议中描述的荧光，通过确定最小酶浓度来计算所需的酶最佳单位，以实现所需的信号衰减。到2'FL产生细胞生长24小时添加β乳糖酶的最佳单位，并在37摄氏度过夜孵育，确定2'FL滴答声，如前面所述。
首先，开始2'FL生产菌株的25毫升培养。一旦在中原阶段诱导该菌株，在37摄氏度下孵育培养24小时。接下来，在 LB 介质中接种大肠杆菌 BL21 培养。
在 37 摄氏度下将其生长到中日志阶段，然后将 15 毫升的这种培养添加到 24 小时 2'FL 培养中。在37摄氏度下孵育3小时。然后，确定如前所述的 2'FL 奶嘴。
首先，开始2'FL生产菌株的25毫升培养。一旦在中原位诱导该菌株，在37摄氏度下孵育培养24小时。在培养中加入两卷 100% 乙醇，并摇好。
在37摄氏度下孵育4小时。然后，将悬浮液在 900 次 g 下离心 15 分钟。收集上清液和孵育过夜在4摄氏度沉淀乳糖。
通过滤纸将溶液传递，以去除沉淀的乳糖。收集包含细胞赖化的滤盐，并确定如前所述的 2'FL 滴答声。本研究采用高通量策略，对富二氧化硅氧化硅进行联杆检测。
这是通过基因工程E.Coli构建全细胞生物传感器实现的，当用特定的甘油诱导时，用荧光信号进行响应。在流量细胞仪上分析的不同感应条件下的荧光信号显示，与仅对病媒或 3'FL 的生物传感器相比，2'FL 生物传感器的荧光度增加了 100 倍以上。这表明生物传感器具有高联动特异性。
通过生成具有不同碳水化合物水平的剂量反应曲线，可以确定测定的敏感性。2'FL 检测的动态线性范围，见为每升 40 至 400 毫克，检测限值为每升 4 毫克。此检测可以在工作日进行，如记者表达式动力学的快照测量中显示的。
生物传感细胞可用于检测和量化工程2'FL生产菌株的2'FL，使用许多策略来减少来自外源乳糖的信号，使读出的信号直接对应于2'FL浓度。一种策略是使用对改性乳糖不采取行动的β乳糖酶。另一种策略是利用乙醇，它不仅选择性地沉淀乳糖，而且使产生细胞，因为细胞解解是一个必要的。
最后，最有效但耗时的方法是细胞解解前对细胞进行颗粒和洗涤，以释放细胞内2'FL。一旦我们建立了这种方法，我们能够使用不同的酶扩展寡糖靶的系列。目前，我们可以检测出9种不同的寡糖，我们正在研究更多。
在优化这种测定时，我们注意到酶的鲁棒性使我们能够想出一种技术，在大约五分钟内给出一个链接特定的读出。虽然这里使用的试剂都不是特别危险的，但使用这种方法的试剂应遵循标准的生物危害和生物控制程序，包括穿着适当的 PPE。
