该协议使用户能够研究临床中使用的侵入性外科手术对肿瘤细胞行为的影响，如迁移、入侵和增殖。此方法独特地允许在侵入性手术之前和之后对同一肿瘤进行可视化，从而提供在非纵向方法中可能遗漏的见解。在确认麻醉成年小鼠对手趾捏没有反应后，将鼠标安装在立体定向框架上，用鼻夹和两根耳杆固定头部。
使用加热灯保持体温，并在动物的眼睛上涂抹软膏。使用锋利的剪刀，将头骨上的皮毛从眼睛剃到头骨底部，并使用 70% 乙醇对裸露的皮肤进行消毒。以圆形方式切割皮肤，并使用棉签刮去暴露的周游毛。
用1%利多卡因和1：100，000浓度的肾上腺素治疗手术区，然后用棉签去除多余的溶液。使用氰丙烯酸酯胶将皮肤边缘粘附在头骨上，并在解剖立体显微镜下以 4 倍放大将立体定向框架放置。接下来，小心钻一个表面的，直径五毫米，圆形凹槽在右皮骨上。
并在凹槽上涂抹一滴皮层缓冲液。使用薄钳提起骨瓣以可视化大脑表面，并使用弯曲、锥形、非常精细的点钳去除杜拉母体。如果出血发生，使用可吸收的明胶海绵实现止血。
对于肿瘤细胞注射，将大约三微升的细胞装入一个装有点式两针的五微升气密注射器。将针头固定到立体机械手手臂上，然后从暴露的组织中去除皮层缓冲液。将注射器的尖端放在颅骨切除术的中间，并将针头插入头骨表面0.5毫米的深度。
然后，在颅骨切除术中加入一滴皮层缓冲液，并使用微注射器喷油器以每分钟 250 到 400 纳米光的速率输送细胞。要准备颅骨成像窗口，请将皮层缓冲液与一滴硅油更换到颅骨切除术位点，以避免窗下出现气泡。用六毫米盖玻片密封暴露的大脑，并在盖玻片和头骨之间涂抹氰丙烯酸酯胶水。
然后用细钳子轻轻按压头骨上的盖玻片。在适当的实验时间点，将鼠标面朝上放在成像盒中，将 25 倍水目标设置为最低 z 位置。向目标添加一大滴水，并将成像盒转移到显微镜的37摄氏度黑暗气候室中。
将目标带到颅骨成像窗口盖玻片，直到水滴触及盖玻片。并使用荧光模式，通过目镜观察肿瘤，使细胞成为焦点。将激光调谐到正确的波长并选择实时模式。
选择多个感兴趣的成像位置后，在软件中记录它们的坐标。为每个位置定义 z 堆栈，以获得肿瘤细胞的最大体积，而不影响肿瘤细胞的分辨率，图像之间的步长设置为三微米。然后，每20分钟获取不同位置的肿瘤体积图像，两小时，每次图像采集前向目标添加水。
获取最后一张图像后，将鼠标传输到加热垫，并监控直至完全恢复。在第一次成像会议后一天，将麻醉鼠标固定到立体轴框架中，并使用丙酮浸湿棉签擦拭盖唇的边缘，直到胶水变软。在盖玻片下滑动 25 量针，并使用薄点钳将其提起，并使用新鲜的皮层缓冲液水合颅骨切除术。
用25针将肿瘤刺到1毫米深，用无菌明胶海绵止住任何出血，用新鲜的硅油封住大脑表面。然后在伤口上粘上一个新的六毫米盖玻片。对于图像分析，请在显微镜软件程序中打开延时 LIF 文件，然后选择"过程"、"处理工具和合并"选项卡。
选择时间序列的第一个图像，然后单击第一个图像。选择时间序列的第二个图像，然后单击第二个图像。在"合并尺寸"中，选择 t 以表示时间，然后单击"应用"。
将生成一个包含两个时间点的新文件。分别跟踪连续三个 z 堆栈的每个延时系列后，将包含延时图像的文件夹拖动到 ImageJ。选择选项卡插件、跟踪和 MtrackJ。
要跟踪每个单独的单元格，请选择"添加"并单击每个时间点的每个单元格。然后单击度量值，然后保存文件以提取轨道的度量值。单个肿瘤细胞的迁移可以通过跟踪 z 堆栈的不同 xy 平面中随着时间的推移的迁移路径，并绘制为活检前和活检后迁移细胞的百分比。
肿瘤细胞增殖率可以根据H2B标记的Dendra2凝结在线粒体上进行量化，并绘制为活检前和活检后分裂细胞的百分比。比较同一肿瘤活检前和后迁移速度的分布，可以发现干预后迁移细胞的数量增加，缓慢细胞与非迁移细胞的数量也随之减少。平均而言，每个肿瘤，当进行活检样损伤时，与对照的未生物实验小鼠相比，观察到迁移细胞的百分比增加了1.75倍。
虽然对照小鼠和活检小鼠的迁徙肿瘤细胞比例最终下降，但活检小鼠的迁移能力仍高于对照小鼠。肿瘤细胞增殖行为也表明，与非生物检对照小鼠相比，活检后线粒体事件的数量增加了1.52倍。值得注意的是，在没有活检的情况下，在颅骨成像窗口置换后，不会观察到肿瘤细胞迁移或增殖的诱导，这表明肿瘤细胞增殖和迁移率的提升是由活检样损伤特别触发的。
在颅骨成像、植入和更换步骤中，以高精度和外科技能工作非常重要。可能需要广泛的实践。
