Bu protokol, kullanıcının klinikte kullanılan invaziv cerrahi işlemlerin göç, invazyon ve proliferasyon gibi tümör hücre davranışları üzerindeki etkisini incelemesini sağlar. Bu yöntem, invaziv bir işlemden önce ve sonra aynı tümörün görselleştirilmesine olanak sağlayarak, uzunlamasına olmayan bir yaklaşımda gözden kaçırılabilen bir içgörü sağlar. Anesteziye dayalı yetişkin farede parmak ucutuya yanıt eksikliğini doğruladıktan sonra fareyi stereotaktik bir çerçeveye yerleştirin ve başı burun kelepçesi ve iki kulak teli ile sabitle.
Vücut ısısını korumak için bir ısıtma lambası kullanın ve hayvanın gözlerine merhem uygulayın. Keskin makas kullanarak, gözlerden kafatası tabanına kafatası kürk tıraş, ve maruz kalan cilt sterilize etmek için% 70 etanol kullanın. Dairesel bir şekilde deri kesin ve maruz periost kazımak için bir pamuklu bez kullanın.
Bir pamuk lu bez ile fazla çözelti çıkarmadan önce beş dakika boyunca% 1 lidokain bir damla ve epinefrin 1:100, 000 konsantrasyonu ile cerrahi alan tedavi. Kafatasına cildin kenarları yapıştırmak için siyanoakrilat tutkal kullanın ve 4x büyütme ile bir diseksiyon stereo mikroskop altında stereotaktik çerçeve yerleştirin. Sonra, dikkatle yüzeysel bir matkap, beş milimetre çapında, sağ parietal kemik üzerinde dairesel oluk.
Ve oluk için korteks tampon bir damla uygulayın. Beyin yüzeyini görselleştirmek için kemik kapağını kaldırmak için ince forsepsler kullanın ve dura mater kaldırmak için kavisli, konik, çok ince nokta forseps kullanın. Kanama oluşursa, hemostaz elde etmek için emilebilir bir jelatin sünger kullanın.
Tümör hücre enjeksiyonu için, beş mikrolitre gaz geçirmez şırınga bir nokta tarzı iki iğne ile donatılmış içine hücrelerin yaklaşık üç mikrolitre yükleyin. Stereotaksik manipülatör kolundaki iğneyi düzeltin ve korteks tamponunu açığa çıkan dokudan çıkarın. Şırınganın ucunu kraniyotominin ortasına yerleştirin ve iğneyi kafatası yüzeyinden 0,5 milimetre derinliğe yerleştirin.
Sonra, kraniyotomi korteks tampon bir damla ekleyin ve dakikada 250-400 nanolitre hızında hücreleri teslim etmek için bir mikroşinga pompa enjektör kullanın. Kranial görüntüleme penceresi hazırlamak için, pencerenin altında hava kabarcıkları önlemek için kraniyotomi sitesine silikon yağı bir damla ile korteks tampon değiştirin. Altı milimetrelik bir kapak kayma ile maruz beyin mühür ve coverslip ve kafatası arasında siyanoakrilat tutkal uygulayın.
Sonra yavaşça kafatasına kapak basmak için ince cımbız kullanın. Uygun deneysel zaman noktasında, fareyi bir görüntüleme kutusuna yüzüstü yerleştirin ve 25x su hedefini en düşük z konumuna ayarlayın. Hedefe büyük bir damla su ekleyin ve görüntüleme kutusunu mikroskobun 37 derecelik koyu iklim odasına aktarın.
Su damlası kapak kaymasına dokunana kadar hedefi kranial görüntüleme penceresi kapağına getirin. Ve epifloresans modunu kullanarak, hücreleri odak haline getirmek için göz merceğinden tümörü gözlemleyin. Lazeri doğru dalga boyuna ayarlayın ve canlı modu seçin.
Görüntüleme için ilgi çekici çeşitli pozisyonlar seçtikten sonra, koordinatlarını yazılıma kaydedin. Tümör hücre çözünürlüğünden ödün vermeden tümör hücrelerinin maksimal hacmini elde etmek için her pozisyon için bir z-deste tanımlayın, üç mikrometreye ayarlanmış görüntüler arasındaki adım boyutu. Daha sonra, her görüntü edinimi önce hedefe su ekleyerek, iki saat boyunca her 20 dakikada bir farklı pozisyonlarda tümör hacmi görüntüleri elde.
Son görüntü alındıktan sonra, fareyi tam iyileşme ye ne kadar takip eden bir ısıtma yastığına aktarın. İlk görüntüleme seansından bir gün sonra, gösterildiği gibi stereotaksik çerçevede anestezili fareyi sabitleyin ve yapıştırıcı yumuşayana kadar kapak kapağının kenarlarını silmek için asetonla ıslatılmış pamuklu bir bez kullanın. Coverslip altında 25 gauge iğne kaydırın ve kaldırmak için ince nokta forseps kullanın ve taze korteks tampon ile kraniyotomi nemlendirin.
25 gauge iğne ile bir milimetre derinliğe tümör delin, steril jelatin sünger ile herhangi bir kanama durdurma, ve taze silikon yağı ile beyin yüzeyini mühür. Sonra yaranın üzerine altı milimetrelik yeni bir kapak yapıştır. Görüntü analizi için, mikroskop yazılım programındaki hızlandırılmış LIF dosyasını açın ve sekme Süreci, İşlem Araçları ve Birleştirme'yi seçin.
Zaman dizisinin ilk görüntüsünü seçin ve önce tıklatın. Zaman dizisinin ikinci görüntüsünü seçin ve ikinciyi tıklatın. Boyutları Birleştir'de zaman için t'yi seçin ve ardından uygula'yı tıklatın.
İki zaman puanı içeren yeni bir dosya oluşturulur. Art arda üç z yığını için her zaman atlamalı seriyi ayrı ayrı izledikten sonra, zaman atlamalı görüntüleri içeren klasörü ImageJ'e sürükleyin. Eklentiler, İzleme ve MtrackJ sekmesini seçin.
Her bir hücreyi izlemek için, her zaman noktasında her hücreye Ekle'yi ve tıklatmayı seçin. Ardından ölçü'ye tıklayın ve parçaların ölçüsünü ayıklamak için dosyayı kaydedin. Bireysel tümör hücrelerinin göçü, z-yığınının farklı ksy düzlemlerinde zaman içinde göç yolunun izlenmesi yle belirlenebilir ve biyopsi öncesi ve sonrası göçmen hücrelerinin yüzdesi olarak çizilebilir.
Tümör hücre çoğalma hızı mitoz üzerine H2B etiketli Dendra2 yoğuşması dayalı olarak ölçülebilir ve biyopsi öncesi ve sonrası bölen hücrelerin bir yüzdesi olarak çizilebilir. Aynı tümörde biyopsi öncesi ve sonrası göç hızının dağılımının karşılaştırılması, müdahaleden sonra göç eden hücre sayısının arttığını ve göç etmeyen hücrelerin yavaşlık sayısında ki azalmanın ilişkili olduğunu ortaya koymaktadır. Tümör başına ortalama olarak, biyopsi benzeri bir yaralanma yapıldığında göçmen hücrelerin yüzdesinde 1.75 kat artış gözlenir, kontrole göre, nonbiyopsisi olmayan fareler.
Göçmen tümör hücrelerinin yüzdesi sonunda hem kontrol hem de biyopsi yapılan farelerde azalsa da, biyopsi yapılan fareler genel olarak kontrol edilen farelerden daha yüksek bir göç kapasitesi sergilemeye devam etmektedir. Tümör hücreli proliferatif davranış da biyopsi üzerine zaman içinde mitotik olayların sayısında 1.52 kat artış göstermektedir, nonbiyopsik kontrol farelergöre. Dikkat edin, biyopsi olmadan kranial görüntüleme penceresi replasmanı sonrası tümör hücre göçü veya proliferasyon indüksiyonu gözlenmez, bu da tümör hücre çoğalması ve göç oranlarındaki artışın özellikle biyopsi benzeri yaralanma ile tetiklendiğini gösterir.
Kraniyal görüntüleme, implantasyon ve değiştirme adımları sırasında yüksek hassasiyet ve cerrahi beceri ile çalışmak önemlidir. Kapsamlı bir uygulama gerekebilir.
