Esse protocolo permite que o usuário estude o impacto de procedimentos cirúrgicos invasivos utilizados na clínica em comportamentos de células tumorais, como migração, invasão e proliferação. Este método permite exclusivamente a visualização do mesmo tumor antes e depois de um procedimento invasivo, fornecendo uma visão que poderia ser perdida em uma abordagem não longitudinal. Depois de confirmar a falta de resposta ao aperto do dedo do pé em um rato adulto anestesiado, monte o mouse em uma armação estereotática e fixe a cabeça com um grampo no nariz e duas barras de ouvido.
Use uma lâmpada de aquecimento para preservar a temperatura corporal e aplique pomada nos olhos do animal. Usando uma tesoura afiada, raspe a pele do crânio dos olhos até a base do crânio, e use 70% de etanol para esterilizar a pele exposta. Corte a pele de forma circular e use um cotonete para raspar o periósteo exposto.
Trate a área cirúrgica com uma queda de 1% de lidocaína, e uma concentração de 1:100.000 de epinefrina por cinco minutos antes de remover a solução em excesso com um cotonete. Use cola cianoacrilato para aderir as bordas da pele ao crânio, e coloque o quadro estereotático sob um microscópio estéreo de dissecção com uma ampliação de 4x. Em seguida, fure cuidadosamente uma superficial, de cinco milímetros de diâmetro, sulco circular sobre o osso parietal direito.
E aplique uma gota de tampão de córtex na ranhura. Use fórceps finos para levantar a aba óssea para visualizar a superfície cerebral, e use fórceps de ponto curvados, afilados e muito finos para remover a dura-máter. Se ocorrer sangramento, use uma esponja de gelatina absorvível para alcançar hemostasia.
Para injeção de células tumorais, carregue cerca de três microliters das células em uma seringa de cinco microlitras equipadas com uma agulha estilo ponto dois. Fixar a agulha no braço manipulador estereotílico e remover o tampão do córtex do tecido exposto. Coloque a ponta da seringa no meio da craniotomia e insira a agulha a uma profundidade de 0,5 milímetros da superfície do crânio.
Em seguida, adicione uma gota de tampão de córtex à craniotomia, e use um injetor de bomba de microsinga para entregar as células a uma taxa de 250 a 400 nanoliter por minuto. Para preparar a janela de imagem craniana, substitua o tampão do córtex por uma gota de óleo de silicone no local da craniotomia para evitar bolhas de ar sob a janela. Sele o cérebro exposto com um deslizamento de cobertura de seis milímetros, e aplique cola cianoacrilato entre o deslizamento e o crânio.
Em seguida, use pinças finas para pressionar suavemente a mancha de cobertura contra o crânio. No ponto de tempo experimental apropriado, coloque o mouse de frente em uma caixa de imagem e ajuste o objetivo de água de 25x para a posição z mais baixa. Adicione uma grande gota de água ao objetivo, e transfira a caixa de imagem para a câmara de clima escuro de 37 graus Celsius do microscópio.
Leve o objetivo para a janela de imagem craniana até que a gota d'água toque o deslizamento de cobertura. E usando o modo de epifluorescência, observe o tumor através da ocular para colocar as células em foco. Sintonize o laser no comprimento de onda correto e selecione o modo ao vivo.
Depois de selecionar várias posições de interesse para imagem, registo suas coordenadas no software. Defina uma pilha de z para cada posição para adquirir o volume máximo de células tumorais sem comprometer a resolução da célula tumoral, com o tamanho do passo entre as imagens definidas para três micrômetros. Em seguida, adquira imagens do volume do tumor em diferentes posições a cada 20 minutos por duas horas, adicionando água ao objetivo antes de cada aquisição de imagem.
Após a última imagem ser adquirida, transfira o mouse para uma almofada de aquecimento com monitoramento até a recuperação completa. Um dia após a primeira sessão de imagem, fixe o rato anestesiado no quadro estereotaxista como demonstrado, e use um cotonete encharcado de acetona para limpar as bordas do deslizamento até que a cola seja suavizada. Deslize uma agulha de calibre 25 sob a mancha de cobertura e use fórceps de ponto fino para levantá-la, e hidrate a craniotomia com tampão de córtex fresco.
Puna o tumor em uma profundidade de um milímetro com uma agulha calibre 25, parando qualquer sangramento com uma esponja de gelatina estéril, e sele a superfície do cérebro com óleo de silicone fresco. Em seguida, cole uma nova tampa de seis milímetros sobre a ferida. Para análise de imagens, abra o arquivo LIF de lapso de tempo no programa de software de microscópio e selecione a guia Process, Process Tools e Merge.
Selecione a primeira imagem da sequência de tempo e clique primeiro. Selecione a segunda imagem da sequência de tempo e clique em segundo. Em Mesclar Dimensões, selecione t para tempo e clique em aplicar.
Um novo arquivo com dois pontos de tempo será gerado. Depois de rastrear cada série de lapso de tempo por três pilhas z consecutivas separadamente, arraste a pasta contendo as imagens de lapso de tempo para ImageJ. Selecione a guia Plugins, Tracking e MtrackJ.
Para rastrear cada célula individual, selecione Adicionar e clicar em cada célula em cada ponto de tempo. Em seguida, clique em medir e salve o arquivo para extrair a medida das faixas. A migração de células tumorais individuais pode ser determinada rastreando o caminho de migração ao longo do tempo em diferentes planos xiy da pilha z e plotada como uma porcentagem das células migratórias pré e pós-biópsia.
A taxa de proliferação de células tumorais pode ser quantificada com base na condensação de Dendra2 marcada por H2B sobre mitose e plotada como uma porcentagem das células divisórias pré e pós-biópsia. Comparando a distribuição da velocidade de migração antes e depois da biópsia no mesmo tumor, revela que o número de células migratórias aumenta após a intervenção, com uma diminuição associada no número de células lentas para não-biológicas. Em média por tumor, observa-se um aumento de 1,75 vezes no percentual de células migratórias quando uma lesão semelhante à biópsia é realizada, em comparação com o controle, camundongos não biopsiados.
Embora a porcentagem de células tumorais migratórias eventualmente diminua tanto no controle quanto em camundongos biópsias, os camundongos biópsiados ainda apresentam uma capacidade migratória maior do que os camundongos de controle em geral. O comportamento proliferativo das células tumorais também demonstra um aumento de 1,52 vezes no número de eventos mitóticos após a biópsia ao longo do tempo, em relação aos camundongos de controle não biopsiados. Note-se que nenhuma indução da migração ou proliferação de células tumorais é observada após a substituição da janela de imagem craniana sem biópsia, indicando que o aumento nas taxas de proliferação e migração de células tumorais é especificamente desencadeado pela lesão semelhante à biópsia.
É importante trabalhar com alta precisão e habilidade cirúrgica durante as etapas de imagem craniana, implantação e substituição. Uma prática extensiva pode ser necessária.
