利用 PiggyBac 载体将人诱导的多能干细胞 (Ipsc) 转化为功能性脊柱和颅内运动神经元

产生运动神经元不同亚型的可能性对于模拟现代运动神经元疾病（如肌萎缩性侧法硬化症）特别相关。此方法允许在短时间内获得具有脊柱或颅骨特性的运动神经元高度刚性的细胞群，并且没有纯化步骤。在简化培养条件下，从诱导多能干细胞或 iPSC 中生成人类运动神经元可能有助于运动神经元疾病的药物筛选。

编程转录因子的可受性表达可用于从 iPSC 存储库生成其他细胞类型，如神经元、骨骼肌和胶质细胞。对于 NIL 和 NIP iPSC 生产线的生成，在 37 摄氏度下用细胞分离试剂处理细胞 5 到 10 分钟之前，使用不含钙和镁的 PBS 冲洗人类 iPSC 培养素。当细胞开始与培养容器分离时，使用 P1000 移液器轻轻地手动分离细胞三到四次。

将细胞转移到15毫升管中，用新鲜的PBS将最终体积调至10毫升，无需钙和镁进行计数。通过离心收集1倍10至第六细胞，然后从电穿孔试剂盒中将颗粒重新在100微升缓冲R中。加入4.5微克可转置载体血浆DNA和0.5微克的小猪贝克转置血浆DNA用于转染。

根据制造商的说明与电池电穿孔系统进行转染，并注明参数。然后，在人类 iPSC 培养基中播种细胞，在 6 毫米基质涂层盘中辅以 10 微摩尔 ROCK 抑制剂 Y-27632。转染两天后，每毫升的沙菲丁加入5微克，使细胞在抗生素中至少保持7至10天，以对抗尚未整合转基因细胞的细胞。

在孵育结束时，保持稳定转染细胞作为混合种群，由具有不同数量的转基因细胞和不同整合位点或分离单个克隆的细胞组成。准备一个额外的菜，允许转基因有效表达每毫升多氧环素诱导一微克，由RT-PCR评估与转基因特异性引因神经原因-2，如前面所述。在现阶段，新款NI和NIP iPSC生产线的库存也应当冻结在人类 iPSC 的冷冻介质中。

对于运动神经元分化，将稳定转染的细胞培养物与分离试剂分离，以允许细胞在含有5卷DMEM/F12培养的15毫升管中采集。离心后，在人类 iPSC 介质中重新补充细胞，并辅以微摩尔 ROCK 抑制剂进行计数。在基质涂层的盘料上以每厘米平方密度的6.25倍10的细胞播种细胞。

在未来两天，用新鲜分化介质代替超食剂，并辅以多氧环素。第二天，将介质更改为神经基础B27介质，辅以伽马分泌酶抑制剂、血管内皮生长因子受体抑制剂和多氧碱。在第五天，分离细胞，如所证明的，并重新暂停分离的细胞在4毫升DMEM/F12介质计数。

移液对于细胞的完全分离非常重要。根据制造商的指示，在细胞冷冻介质中冻结运动神经元祖体，通过离心收集其余细胞。在神经元介质中重新吸收颗粒，辅以10微摩尔 ROCK抑制剂。

聚乙烯层压微滑基上支持多晶硅的细胞，聚合物覆盖滑在10至第五厘米平方密度的5个细胞之间。第六天，小心地用新鲜的神经元介质代替培养，直到下游分析，不分离细胞从支撑表面。在没有泛神经元标记神经元特异性三类β-tubulinTUJ1的积极性的情况下，可以在第零天区分细胞培养物时观察到多能标记八位结合转录因子四或OTC4的统一表达。

在第三天，OCT4阳性细胞的数量明显减少。这由 TUJ1 在区分 iPSC 的子集中的表达式镜像。在第五天，在种群中未观察到 OCT4 的表达，这显示了 TUJ1 和后天神经元形态的一致表达。

运动神经元祖细胞重放7天后的免疫着色分析揭示了TUJ1和成熟运动神经元标记胆碱乙酰转移酶的均匀表达。iPSC NIL衍生神经元成功显示电压依赖性钠电流和电压依赖性钾电流。80% 的 iPSC NIL 衍生电机神经元在电流夹紧模式中夹紧，当注入电流脉冲加 60 皮安或更多时，能够触发尖峰训练。

在超过50%的记录的细胞中引起重复发射所需的最小电流是加40皮安，峰值阈值约为负38毫伏，平均发射频率为40皮安，约8赫兹，这表明iPSC NIL衍生的脊髓运动神经元表现出成熟的神经元的典型功能特性。脊髓和颅体运动神经元可以从携带病理突变的受控 iPSC 或 iPSC 中衍生，这些细胞可用作论文模型或药物筛选。我们的方法可以用来帮助理解为什么不同的运动神经元单元受到ALS的差分影响。