神经干细胞和祖细胞可以自我更新，分化成不同的神经细胞类型，支持神经系统的发展，为再生医学提供资源。这些细胞是异质的，我们需要知道他们特定的细胞表面标记，以获得纯化细胞群并了解其功能。我们的协议提供了一种简单、敏感、高效的技术来分析原发神经干细胞和祖细胞的膜蛋白，帮助识别这些细胞的新表面标记。
我们协议的主要优点是能够直接分析原发神经干细胞和祖细胞的表面蛋白质组，提高灵敏度和特异性。这是通过体外内皮细胞中的共培养和高道林内在细胞 MAPK-ERK 通路来标记表面孔隙而实现的。通过孔隙在体外扩张干细胞的亲修饰，我们的协议可以很容易地应用于识别其他干细胞类型的表面标记。
为了准备内皮细胞，在90%与9毫升BEN3细胞培养基的汇合下，从10厘米培养皿中重新悬浮BEN3细胞颗粒。将一毫升的细胞悬浮液加入一个可渗透的支撑插件中。在矩阵的底部腔室中，每井再添加两毫升BEN3介质。
继续培养细胞在37摄氏度下用5%的二氧化碳培养一天。电镀刀片中的细胞后一天，轻轻吸气介质，首先从底部腔室，然后从刀片。使用预热的 DMEM 清洗刀片的面三次。
使用预热的 DMEM 冲洗，清洗刀片的外表面。接下来，将一毫升预热 AM 添加到一个插入中。使用主皮质细胞将刀片转移到孔中。
在37摄氏度下用5%的二氧化碳孵育共培养12小时。在 DMSO 中溶解 Ac4ManAz，实现 200 毫摩尔的库存浓度。从培养箱中检索神经内皮共培养板。
在每个底腔室中添加一个 Ac4ManAz 库存的微升，每个插入到共培养器中添加 0.5 微升。在37摄氏度下培养细胞，用5%的二氧化碳培养细胞5天。在培养细胞时，每插入物添加100微升RM，每底室添加200微升RM，每隔一天再为内皮细胞和神经细胞重新喂养。
首先从共培养板中去除刀片，并从井底吸出培养介质。接下来用预热的PBS清洗神经细胞一次。从油井中吸出 PBS，并在 PBS 中加入一毫升预冷却的 4% 甲状甲醛。
在室温下固定细胞10分钟。然后用预冷的PBS清洗细胞三次。吸气PBS，并添加一毫升新鲜准备的生物素结合缓冲液1到每孔。
在室温下孵育10分钟。在此之后，从井中吸出反应缓冲液，用PBS洗三次细胞。在细胞的每个井中加入一毫升染色缓冲液，并在室温下孵育30分钟。
接下来，从井中吸出染色缓冲液，用预冷却的PBS清洗细胞三次。将一毫升阻断缓冲液加入每个细胞井，并在室温下孵育10分钟。从油井中去除阻塞缓冲液，并在每个油井中加入一毫升的原抗体溶液。
在摄氏四度下孵育细胞。第二天，从井中去除原抗体溶液。用预冷的PBS清洗细胞三次。
从井中吸出PBS，并在每口井中加入一毫升的二级抗体。在室温下孵育细胞两小时。在此之后，从井中吸出溶液，用预冷的PBS洗三次细胞。
首先，准备BTTAA杯硫酸盐复合物2、全蛋白重悬浮缓冲液、蛋白质洗涤缓冲液1、蛋白质洗涤缓冲液2和蛋白质洗涤缓冲液3，如文本协议中所述。接下来，从共培养板中卸下刀片。从底部孔中吸出培养培养，用预冷却的PBS清洗神经细胞一次。
吸气 PBS，并在每口井中加入 200 微升预冷却 RIPA 缓冲液。在冰上孵育板5分钟，然后将蛋白质解解收集到1.5毫升管中。在 12000 倍 G 和 4 摄氏度下离心 10 分钟，以对细胞碎片进行颗粒。
将上清液转移到新的1.5毫升管中，并根据制造商的说明使用BA试剂盒确定蛋白质浓度。然后，将蛋白质浓度调整为每毫升一毫克。加入100微摩尔氧化铝生物素，2.5毫摩尔钠抗坏血酸和1XBTTAA硫酸盐复合物2至1毫升蛋白质解解。
将溶液混合好，在室温下孵育一小时。在此之后，将反应溶液转移到20毫升预冷却甲醇50毫升锥形管中。混合好，在零下30摄氏度过夜孵育，沉淀蛋白质。
在4500倍G和4摄氏度下离心15分钟，使蛋白质沉淀。每次洗涤使用 20 毫升预冷却甲醇两次清洗颗粒。接下来，吸上清液，将蛋白质颗粒重新悬浮在四毫升的再悬浮缓冲液中。
将蛋白质重新悬浮转移到新的15毫升锥形管中。用PBS洗涤50微升的链球菌珠三次。将洗涤的珠子加入蛋白质重新悬浮，在4摄氏度下以20转/分的旋转速度在垂直旋转器上孵育溶液3小时。
在此之后，用此处显示的每个洗涤缓冲液按顺序清洗珠子。用 20 微升 PBS 重新悬浮洗涤的珠子，然后将它们转移到新的 1.5 毫升管中。加入20微升2X蛋白质加载缓冲液，在95摄氏度下治疗10分钟。
然后使用SDS-PAGE处理蛋白质样本，然后用文本协议中概述的库马西辉煌蓝染色。在这项研究中，初级胚胎NSPC在体外被扩大和代谢标记。成功的内皮共培养导致 NSPC 形成大型工作表样克隆。
抗体的免疫破坏表明，在克隆中，大多数细胞是内辛阳性NSPC，而很少是β-图布林3阳性神经元细胞。相比之下，在非共培养系统中形成的克隆细胞中，内辛阳性细胞和β图布林3个阳性神经元细胞的百分比几乎相同。化学记者Ac4ManAz是一个代谢模拟，可以并入内在蛋白质亚基化通路。
使用100微摩尔用于初级NSPC的优化标签浓度，细胞和核形态指示的细胞死亡组合评估表明，这种标记浓度不会引起明显的细胞毒性效应，并且能够有效地标记NSPC。内皮共培养和非共培养系统中的NSPC的克隆形态、自我更新和分化潜力不受影响。从 Ac4ManAz 中通过生物素结合和链球菌珠纯化标记培养物的蛋白质样本在 SDS-PAGE 凝胶中显示了强大的库马西辉煌蓝色染色信号。
同时，在装有DMSO对照组的蛋白质样本的车道上，只有染色背景和非特异性结合信号。这也表明 Ac4ManAz 对 NSPC 进行有效标记。在尝试此协议时，生物细胞反应所需的所有溶液都应新鲜准备，反应时间应严格控制，以防止反应过度。
按照我们的协议，可以分析神经干细胞富集表面甘油的结构。我们的神经干细胞和祖细胞富集表面蛋白的规程不仅上升标记，而且对凸起模式纯化策略和该细胞群体刚性信号电路的图示也起着重要作用。
