遗传性痉挛性截瘫中人类诱导多能干细胞衍生神经元的线粒体迁移与形态分析

线粒体功能障碍是许多神经退行性疾病的基础。我们的协议为检查轴突中的线粒体动力学提供了一个重要工具，有助于研究涉及轴突退化的神经系统疾病。通过结合线粒体标记、活细胞成像和诱导多能干细胞技术，我们的协议可用于特征线粒体随用轴线体贩运，并分析其形态。

在干细胞培养和神经退行性疾病的动物模型中可以观察到线粒体运输和形态受损，为治疗这些疾病提供了潜在的治疗目标。经过第35天的培养，分离出与人类诱导多能干细胞区别的神经球，以1mg/ml的细胞分离溶液在37摄氏度下两分钟。在孵化结束时，通过离心收集细胞簇，并在NDM的一毫升中重新塞粒。

板约五簇细胞在一百微升中每多余物氨酸和乳糖脱氢酶提升无病毒降低生长因子地下室膜基质涂覆35毫米玻璃底盘。然后添加一毫升NDM，辅以B27、环状腺苷单磷酸盐、胰岛素样生长因子、人脑衍生神经营养因子和胶质细胞衍生神经营养因子。要沿前脑神经元轴突的线粒体可视化，首先在NDM中用50纳米摩尔红色荧光染料染色神经元，在37摄氏度下进行三分钟，然后用温暖的NDM洗涤两次。

接下来，将培养力置于荧光显微镜的舞台上，并选择 40 倍目标。在相场下，根据轴的形态特征识别轴子。要区分线粒体沿轴突运动的方向，可以清楚地识别神经元的细胞体。

区分细胞体和轴突后，调整轴突中线粒体的暴露时间和焦点，每五秒钟捕获轴突内的线粒体传输，共五分钟。要分析 ImageJ 中线粒体传输打开斐济，并选择生物格式插件。使用生物格式导入器导入 tiff 系列的延时图像，并选择标准 ImageJ 和打开所有系列。

检查自动缩放分割通道，然后单击"确定"以像素为单位注意图像的帧数和大小。调整所有 60 帧的亮度和对比度后，使用分段线绘制一条线，从单元格主体到端轴。要生成 Kymograph，请选择多个 Kymograph 插件并选择线宽。

测量移动线粒体打开 tsp050607 的距离、时间值和速度。txt 在宏插件中。并在线粒体从上位到劣等区域的线粒体运动轨迹上画一条分割线。

绘制行后打开从宏插件中的 tsp 读取速度，以读取与线对应的分段速度。接下来打开原始图像，并使用线条工具沿比例图条绘制一条线。选择"分析"可测量线的长度，并将 dx 现在和距离单位从像素转换为微米。

然后将时间从像素更改为秒。要分析 ImageJ 中轴突内的线粒体长度和面积，请安装拉直下划线 DOT JAR 插件，并打开感兴趣的轴突图像。将 32 位图像转换为 8 位，并使用分段线工具跟踪轴孔。

选择"直划下划线 JAR"插件，将灯丝宽线的宽度设置为 50 像素。再次跟踪轴孔以生成拉直的轴孔并调整图像阈值。选择分析集测量周长拟合椭圆和形状描述符以设置测量值并使用线函数测量原始图像中的比例条，如所示。

在"分析"下设置比例输入以像素为单位的距离和长度单位以设置比例。然后选择全局，将比例设置为所有图像。最后选择分析粒子以确定面积，并选择显示结果以查看生成的测量结果。

分化成电脑谷胱甘肽神经元后，细胞可以由其T-B-R一和β三管状蛋白标记表达来描述。使用红色荧光染料染色和延时成像可以评估线粒体的斧头运输。单个线粒体可以保持静态或在轴突内逆行或逆行方向移动。

线粒体沿轴线体运动的速度可以量化，如图所示。例如，使用市售分析软件，与野生型神经元相比，S-P-G-3-A神经元中运动线粒体的百分比显著降低。要分析线粒体面积长度和纵横比轴突可以在图像分析软件中拉直，并通过调整阈值进行选择。

线粒体区域周长宽度和纵横比可以从拉直的轴突获得。例如，线粒体长度和纵横比在S-P-G 15神经元轴突中显著减少，而控制野生型轴突。加热培养介质和显微镜培养箱以轻轻清洗细胞，使细胞在成像前稳定20分钟是十分重要的。

活细胞成像后，培养物可以固定并进行免疫污染，以检查其他感兴趣的蛋白质的表达。研究活人神经中的线粒体动力学是具有挑战性的。该技术为研究神经系统疾病的线粒体动力学和神经退化提供了独特的工具。