使用 En 面免疫荧光染色直接观察血管内皮细胞

该协议帮助人们分析内皮细胞形态，以及不同流体剪切应力下区域分子的表达。该技术的主要优点是，它提供了不同流体剪切应力下的血管内皮细胞的直接评估。执行此过程时，关键步骤是使用新鲜准备的甲醛，并执行良好的灌注。

从 12 周前的 C57BL/6 鼠标麻醉开始此过程，如文本协议中所述。通过轻轻捏住尾巴来确认正确的麻醉。用胶带把鼠标的爪子用胶带把鼠标的爪子用一叠纸巾粘起来。

用钳子握住老鼠的皮肤，用一把剪刀从腹部切到胸部顶部。用一把锋利的剪刀打开肋骨下方的腹腔。用钳子抬起胸骨，然后切割隔膜。

然后切开肋骨，露出胸腔。用剪刀切断肝脏上方的维娜卡瓦。压力通过左心室，使动脉树承受五分钟，预冷却的正常盐水每毫升肝素含有40个单位，直到肺部和肝脏变得苍白。

然后在PBS中用预冷却的4%甲醛进行4分钟。去除所有的肌肉，器官和脂肪，直到大母骨暴露。将鼠标放在解剖显微镜下。

使用细腻的钳子和一把精致的剪刀在解剖显微镜下清楚地暴露大动脉，并尽可能干净地去除大动脉的结缔组织。用一把细腻的剪刀将胸主动脉从心脏解剖到腹腔躯干。将大母板放入六厘米的细胞培养盘中，并配以PBS。

纵向切开主动脉，首先沿着较小的曲线，然后使用微切口切开主动脉拱的三根分支，包括主动脉、左普通胡萝卜和沿大曲线的左亚克拉维安动脉，直到出现直线段。用1%聚氧乙烯八基苯醚在PBS中渗透大母10分钟。然后在室温下用10%正常山羊血清在含有2.5%多糖酸20的三分液盐水中阻断大母，在12孔细胞培养板中阻断1小时。

接下来孵育大母油在阻断缓冲液中含有5克每毫升兔子抗VCAM1，和五克每毫升大鼠抗V-Cadherin，在4摄氏度过夜。用洗涤溶液冲洗样品三次后，在室温下应用荧光结合二次抗体一小时，保持在黑暗的地方。在洗涤液中再冲洗三次。

用 DAPI 对大道进行对，对着 10 分钟，保持在黑暗的地方。然后在洗涤液中冲洗染色大干母板三次。将大母板放在带流明表面的盖滑上，然后缓慢地移动到以前掉在盖滑上的防淡安装溶液。

轻轻伸展大母，使试样保持平整。反转盖滑，放在玻璃滑梯上。注意避免试样和玻璃之间有任何气泡。

使用激光扫描共体显微镜检查大母体。使用 Image-Pro Plus 软件分析不同通道在 en 面图像中所需区域的颜色强度。显示小鼠大动脉血管内皮细胞的免疫荧光染色图像。

血管细胞粘附蛋白一的免疫荧光，以及以维-卡德林作为内皮标记的表达，在小鼠大动脉不同区域的不同流动模式下显示。DAPI 也反面显示细胞核，以便更好地可视化。在显微镜下查看 Z 堆栈时，内皮和平滑的肌肉细胞可以很容易地通过细胞核形态来区分。

内皮细胞核为椭圆形，比主轴形状、平滑的肌肉细胞核大。与稳定流动下的区域相比，VCAM-1在扰流区域、大弓曲率较小的区域、大弓拱门曲率较大的区域和胸大大项的表达更为丰富。在这里，小鼠大血管曲率较小的区域表示为 d 流区域，曲率和胸角较大。

通过正确的修改，该技术还可用于血管渗透性分析，以及大分子在内皮细胞内膜的位置。