このプロトコルは、人々が異なる流体せん断応力の下で、内皮細胞形態、および領域における分子の発現を分析するのに役立ちます。この技術の主な利点は、異なる流体せん断応力下で血管内皮細胞の直接評価を提供することです。この手順を実行する場合、重要なステップは、作りたてのパラホルムアルデヒドを使用し、良好な灌流を行うことである。
テキスト プロトコルで説明されているように、12 週齢の C57BL/6 マウスの麻酔を使用して、この手順を開始します。尾を軽くつまんで適切な麻酔を確認します。マウスの足を粘着テープでペーパータオルの積み重ねにテープで貼ります。
マウスの皮膚を鉗子で持ち上げ、腹部から胸郭の上部まではさみで皮膚を切ります。腹腔を開き、胸部の下に鋭いハサミで開きます。胸骨を鉗子で持ち上げ、横隔膜を切ります。
その後、胸部を切り取って胸腔を露出します。肝臓のすぐ上の大静脈をはさみで切り落とします。圧力は動脈樹を5分間浸透させ、肺と肝臓が青白くなるまで、1ミリリットルのヘパリン当たり40単位を含む冷やされた正常な生理食塩水を左心室を通り抜ける。
その後、PBSで4%パラホルムアルデヒドを4分間冷やして4%パーフューズします。大器官が露出するまで、すべての筋肉、器官、脂肪を取り除きます。マウスを解剖顕微鏡の下に置きます。
繊細な鉗子と繊細なはさみを使用して、解剖顕微鏡の下で大オルタをはっきりと露出させ、大オルタに沿って結合組織をできるだけきれいに取り除きます。胸部大分を心臓からセリアックトランクまで繊細なはさみで解剖する。大大ターをPBSで6センチメートルの細胞培養皿に入れます。
大動脈を縦方向に切り開き、最初に小さな曲線に沿って切り開き、次にマイクロシザーを使用して、結節、左共通頸動脈、および左鎖骨動脈を含む大動脈アーチの3つの枝を切断し、直線セグメントが満たされるまで大きな曲線に沿って切断する。1%ポリオキシエチレンオチルフェニルエーテルで大オルタを透過し、PBSで10分間透過させる。次に、2.5%ポリソルベート20を含むトリス緩衝生理食類で10%正常ヤギ血清を12ウェルセル培養プレートで1時間ブロックします。
次に、1ミリリットルウサギの抗VCAM1あたり5グラム、1ミリリットルラット抗VEカドヘリン当たり5グラムを含むブロッキングバッファーに大オルタを4°Cで一晩インキュベートする。洗浄液で試料を3回洗浄した後、蛍光コンジュゲート二次抗体を室温で1時間塗布し、暗所に保管する。洗浄液に3回洗い流す。
DAPIで大オルタに対抗し、暗い場所に保管します。次に、染色した大オルタを洗浄液中で3回洗い流します。大間は、内腔表面を下方に覆われたスリップに置き、以前にカバースリップに落とされたアンチフェード実装溶液にゆっくりと動かします。
大大離を軽く伸ばして標本を平らに保ちます。カバースリップを反転し、ガラススライドの上に置きます。試料とガラスの間の気泡を避けるように注意してください。
レーザー走査共焦点顕微鏡で大オルタを調べます。enフェイス画像の目的の領域から異なるチャンネルの色強度を、Image-Pro Plusソフトウェアで解析します。マウス大動脈からの血管内皮細胞の蛍光エン顔免疫蛍光染色画像が示されている。
血管細胞接着タンパク質1の顔面蛍光、およびVE-カドヘリンを内皮マーカーとして発現し、マウス大動脈の異なる領域からの様々なフローパターンの下で示されている。DAPIはまた、より良い視覚化のために細胞核を示すために対抗した。顕微鏡下でZスタックを見ると、内皮細胞と平滑筋細胞は、細胞核形態によって容易に区別することができる。
内皮細胞核は楕円形であり、紡錘形の平滑筋細胞核よりも大きい。VCAM-1の発現は、大大小アーチの曲率が小さい領域、安定した流れの下の領域、大大門アーチのより大きな曲率、および胸部大オルタの領域において、より豊富であった。ここでは、マウス大オルタの湾曲率が小さい領域は、d流れ領域、および大きな湾曲および胸部として示される。
適切な修飾により、この技術は血管透過性の分析、および内皮細胞内の高分子の位置の分析にも適用することができる。
