生理树突抗原呈现细胞，即PhDC，是启动抗原特异性T细胞免疫和耐受性的免疫主开关。本文阐述了一种生产PDC的高效方法。树突状细胞的临床应用受到用于生产树突状细胞因子的非生理细胞因子方法的阻碍。
我们的方法通过人类和小鼠单细胞到直流转换的高效血小板信号克服了这一问题。这些 PhDC 不依赖于体内不可用的细胞因子条件，因此它们可以在人类和患有已证实的癌症的小鼠中产生有效的临床抗肿瘤 T 细胞反应。单细胞到PhDC成熟与物种无关的血小板启动具有广泛的实验适用性。
PhDC允许解剖树突状细胞生理学，促进免疫原癌的治疗性抗癌免疫诱导，并为个性化抗菌疫苗接种提供前景。该实验系统新颖，其多个方面，如塑料室的涂层，肿瘤细胞治疗8-MOP/UVA，流动条件，单细胞的释放是最佳的视觉表现。演示这个程序的将是伊芙·罗宾逊，一个来自我实验室的技术员。
为了收集外周血单核细胞，首先建立一个15毫升的管，每5到10只老鼠流血，有4毫升淋巴细胞分离介质。然后慢慢将从带肿瘤的小鼠身上采集的血液层在介质上。在1000至1500倍-G下旋转细胞20分钟，将PBMC从红血球分离。
离心结束时，收集顶部血浆层，将0.5毫升的毫克留在薄漆上方，并储存在4摄氏度内供以后使用。接下来，将薄涂层层收集到充满 PBS 至 15 毫升的清洁 15 毫升管中，并在标准组织培养离心机中以 250 倍 G 旋转 10 分钟，收集 PBMC。离心结束时，小心地移液器关闭上经剂，轻拂管子以重新暂停颗粒。
然后向管中加入两毫升的 ACK 红细胞解液缓冲液，从 PBMC 中去除剩余的红血球。在冰上孵育PBMC10分钟。用 PBS 填充管至 15 毫升，并在标准组织培养离心机中以 250 倍-G 的电转 10 分钟收集 PBMC。
小心地移液关闭上流液，轻拂管子以松开颗粒。将颗粒重新在 300 微升 FBS 中。为了准备每个治疗组的YUMM1.7肿瘤细胞，首先将FBS中的肿瘤细胞颗粒重新以每300微升250万个细胞重新暂停。
关闭组织培养罩后，将 8-甲氧丙酮添加到 YUMM1.7 肿瘤细胞悬浮液中，最终浓度为每毫升 100 毫微克。接下来，混合细胞，用铝箔包裹细胞容器，在37摄氏度下孵育20分钟。要预涂一个12井组织培养板，每组5只小鼠加入一毫升FBS，并在4摄氏度下冷藏20分钟。
20分钟后，在组织培养罩下，从井中去除FBS，每口井加入300微升的甲氧丙酮暴露肿瘤细胞。然后将含细胞的板暴露在预热的紫外线 A 光源中，使每平方厘米总照射四焦耳。从每口井中收集8个甲氧丙酸/UVA治疗的肿瘤细胞，小心地旋转板和移液器，以确保细胞完全恢复。
要对每组5只小鼠进行转免疫板通道，将300微升的合适PBMC和300微升的8-甲氧丙酮/UVA治疗的肿瘤细胞混合在1.5毫升的圆锥管中，混合细胞。接下来，打开 TI 板的入口和出口管夹。使用 10 毫升注射器将 TI 油管装满 FBS，在管子充满时关闭夹子以将 FBS 保留在管内。
断开注射器。将 P1000 移液器尖端牢固地放入 TI 板进气口中。以 45 度角握住板，用 PBMC 和肿瘤细胞混合缓慢填充板，避免气泡。
在松开移液器柱塞之前，请从进气口中拆下移液器尖端。将剩余的细胞返回到 1.5 毫升锥形管。在37摄氏度下孵育充满FBS的管子、充满细胞的TI板和1.5毫升锥形管，这些结锥管含有组织培养箱中剩余的细胞，需要一小时。
孵育后，松开夹子，通过重力排空 TI 管。然后将 P1000 移液器尖端插入板端口，将柱塞压入板端口，以从 TI 板上取出电池。以 45 度角握住板，并填充 P1000 移液器尖端。
将细胞放回其原始的1.5毫升锥形管中。要运行 TI 板，请将出口管连接到板，然后将 TI 板固定到板运行系统中。接下来，使用一毫升注射器，从1.5毫升锥形管中绘制出PBMC和肿瘤细胞混合的600微升。
将注射器连接到插入管上，打开夹子，然后慢慢填充，直到液体到达管子的末端。将入口管的自由端连接到 TI 板，然后继续轻轻加载剩余的体积。完成后关闭入口夹。
拆下单毫升注射器，将入口管连接到注射器泵。将出口管固定到干净的 1.5 毫升锥形管中，以收集细胞。将注射器泵的流量调整为每分钟 0.09 毫升。
使用 TI 板运行平台将 TI 板向注射器泵侧倾斜约 30 度。小心地松开入口管上的夹子。启动注射器泵，仔细观察 TI 板的填充情况。
一旦 TI 板完全充满，在清空时，朝相反方向倾斜约 30 度。当液体中的所有细胞都在 1.5 毫升锥形收集管中时，停止泵。要清洗 TI 板，请断开入口管与注射器泵的连接，然后将其连接到装满 600 微升 FBS 的一毫升注射器。
填充，直到 FBS 完全加载。然后断开注射器，将管子连接到注射器泵上。将注射器泵的流量调整为每分钟 0.49 毫升。
松开入口夹，运行 TI 板，将洗涤液收集在同一 1.5 毫升锥形管中。轻拂或轻按 TI 板的整个时间，以帮助分离和分离任何粘附的细胞，因为板清空。断开收集 1.5 毫升锥形管与 TI 板设置的连接。
在台式微浮子中旋转收集管，在 250 次 G 下旋转 8 分钟，然后丢弃上一液。为了进行PBMC与抗原的隔夜共育，首先在两毫升透明RPMI中重新暂停PBMC和肿瘤细胞颗粒，并辅以15%的自体小鼠血清。然后在35毫米非组织培养处理无菌盘中的板细胞，并在标准组织培养条件下孵育过夜。
第二天，用组织培养刮刀小心地从盘子底部分离出任何粘附细胞。刮擦时旋转盘子，确保细胞收集均匀。将细胞收集在15毫升的管子中。
将两毫升 PBS 加入盘中，然后重复刮擦步骤，将细胞收集到同一管中。用一毫升 PBS 冲洗 35 毫米的盘子，然后将冲洗添加到同一管中。在标准组织培养离心机中旋转250倍-G，10分钟收集细胞。
小心地移液关闭上流液，然后轻拂管子以重新暂停颗粒。该疗法显示，在100多只治疗小鼠与对照小鼠相比，YUMM1.7肿瘤生长减少，在两年内进行的9次独立实验的累积肿瘤生长数据中观察到。单个动物在一个实验中具有代表性的肿瘤生长曲线提供了系统中的变异感。
当单细胞或血小板从PBMC分数中耗尽时，或当板通道被省略时，不再观察到治疗效果。在没有免疫细胞或抗原来源的情况下，或在存在不匹配的抗原的情况下，如使用MC38结肠癌细胞治疗的YUMM1.7肿瘤，治疗无效。对于免疫结果，也至关重要的是避免PBMC接触8甲氧丙酮。
FACS分析，在新鲜分离的PBMC、TI处理的PBMC、无板通道的TI处理的PBMC、板通过前耗尽的血小板或上述两者之间，人类CD11c+细胞中相应IgG控制物指示标记的变化表明，直流激活取决于PBMC和TI板通道中血小板的存在。TI 激活的人类DC可以有效地处理和交叉呈现肽抗原，或从整个8-甲氧丙酸暴露的人类肿瘤细胞的抗原，以TI和血小板依赖的方式激活人类抗原特异性T细胞系。T细胞反应的特异性取决于加工后抗原的来源。
在诱导抗癌免疫时，必须对每一个癌细胞系的凋亡进行滴定，以最大限度地提高免疫原性。由于诱导免疫将特定于免疫抗原，详细解剖每个系统将是可能的。每个实验或临床癌症，以及每种抗菌反应，都将具有独特的信息。
每个人类癌症都有自己的肿瘤特异性抗原阵列。PhDC 对肿瘤抗原进行必要的分选和呈现，无需事先进行实验室鉴定。请记住，8-MOP 和 UVA 光是致癌物质。
在操作 8-MOP 和使用 UVA 光源时，请使用适当的防护设备并遵循安全程序。
