嵌套RT-PCR已开发检测所有莱萨病毒，包括所有16个ICTV批准和两个新的莱萨病毒物种。在中国10年的临床狂犬病诊断和监测中，利用9000多个动物脑标本验证了这种方法。嵌套的RT-PCR不仅能对新鲜的脑组织样本产生可靠的结果，还可以在降解的样品上产生可靠的结果。
这种方法可用于检测生尿液标本，如脑脊液、唾液和尿液，因此该方法可应用于最后通令诊断。为了最大限度地减少 PCR 结带污染，准备消极和积极的控制措施非常重要，采取措施非常重要。例如，对于每种RNA提取需求制备，PCR设置和凝胶电泳应在物理上独立的区域操作。
还建议在RNA提取和逆转录中使用螺旋胶带，以防止狂犬病污染肽链。正确处理，如在冰上准备您的制剂，定期更换手套，以及使用无核糖核酸酶材料，将防止核糖酶的引入，并消除RNA的降解。为了开始这个程序，从狂犬病疑似组织、皮肤活检、唾液、脑脊液或RABV感染细胞培养中提取RNA，如文本协议中所述。
准备好继续操作时，从冰柜中取出所需的试剂，并放在冰上。使用前，请确保解冻并旋转每个试剂。对于病毒RNA到cDNA的逆转录，为冰上每个样品和1.5毫升离心管制备12微升的反应混合物，如洁净室文本协议表1中所述。
要考虑移液变化，请准备至少一个比所需大小大的主混合物，然后将反应混合物分成 0.2 毫升 PCR 管。在模板室的 PCR 工作站中，将样品的八个微升或其中一个控件添加到反应组合中。阳性对照是从感染固定RABV菌株CVS11的细胞培养物中提取的RNA，而负对照含有无Rnase双蒸馏水。
首先涡旋，然后短暂离心，混合每个管的内容。在此之后，将反应管加载到热循环器中。设置并运行文本协议中概述的 cDNA 合成程序。
首先，取回必要的试剂，并把它们放在洁净室的冰上，直到准备好使用。准备就绪后，解冻并旋涡试剂。接下来，根据文本协议表2中概述的1.5毫升离心管中每个样品准备48微升第一轮PCR混合物，将反应混合物分成0.2毫升PCR管。
在模板室的 PCR 工作站中，将 cDNA 的两微升样本添加到第一轮 PCR 混合中。包括两个CVS11 cDNA的微升作为正对，两个微升的双蒸馏水作为负对。然后，将密封管转移到 PCR 热循环器中，并使用文本协议表 3 中列出的参数循环。
首先，根据文本协议表4中概述的1.5毫升离心管中每个样品准备48微升第二轮PCR混合物，将反应混合物分成0.2毫升PCR管。将第一轮 PCR 产品的两个微升添加到第二轮 PCR 组合中。包括双蒸馏水作为本轮PCR的负对。
然后，使用文本协议表 3 中列出的参数执行 PCR 热循环。首先，在100毫升三醋酸EDTA中加入1.5克的气糖，并在微波炉中加热，将其彻底溶解。接下来，以0.01%的最终浓度加入溴化乙酰胺，将凝胶倒入模具中，并在环境温度下凝固至少30分钟。
通过将每个 PCR 产品的五微升与一个 6 倍加载缓冲器的微升混合来准备加载样品。将样品和合适的DNA标记物单独加载到井中，在120伏特下运行凝胶约30至45分钟，直到染料线在凝胶下约75至80%。运行完成后，关闭电源并断开电极与电源的连接。
然后，小心地从凝胶盒中取出凝胶。使用紫外凝胶记录设备可视化和拍摄DNA片段。如文本协议中所述，对嵌套的反向转录 PCR 进行描述。
此处显示了一个代表性嵌套的 RT-PCR 检测 18 个 Lyssa 病毒物种的结果。PCR 正对显示第一轮放大时 845 个碱基对的预期波段，第二轮放大的 371 个基对的预期波段。对于负控件，未看到带。
所有 18 个 Lyssa 病毒都被认为产生与阳性对照相同的两个波段，表明嵌套的 RT-PCR 检测到所有 18 个 Lyssa 病毒。虽然16个质粒在两轮PCR中有效扩增，其中两个质粒，即阿拉万病毒和Ikoma病毒，只在第一轮或第二轮被放大。该方法的灵敏度在检测不同的莱莎病毒质粒时各不相同，从每微升2.24到2，240分子不等。
这些差异可归因于由于病毒序列多样性导致的底像和模板之间的不匹配。对通过嵌套 PCR 测试的临床标本中的 9，624 个脑组织与 FAT 测试的脑组织进行比较后发现，嵌套RT-PCR的灵敏度为100%，特异性为99.97%。所有 10 个实验室获得的嵌套 RT-PCR 结果都符合 FAT 的 100%，无假阴性或误报，表明嵌套的 RT-PCR 具有高特异性和可重复性。
RT-PCR 现在被国际动物技术研究公司推荐用于狂犬病技术。我们的嵌套RT-PCR已被证明是2018年中国狂犬病技术国家标准。
