这里描述的方案允许生成长度高达10 KB的单链阳性RNA病毒基因组的随机诱变全长RNA文库，并在所需的实验条件下选择感兴趣的表型。该技术可以使用无克隆方法在短时间内创建具有不同遗传多样性水平的全长病毒RNA文库。该技术利用廉价且广泛可用的试剂进行文库合成。
Shiv Nadar 大学生命科学系病毒学系的博士生 Shaheen Khan 将演示该程序。首先，通过制备用于四组实验的预混液进行 ep-PCR，使用正向和反向引物以及没有 pJFH1 模板的反应组分，如文本手稿中所述。将预混液分装到四个试管中。
将 100 纳克、50 纳克、25 纳克和 10 纳克的模板加入各个试管中，并将反应的总体积调节至 50 微升。应用循环条件扩增 97 个 36 碱基对片段。通过加载5微升PCR产物并将其与已知量的1千碱基DNA分子量标准进行比较，通过运行基于0.8%TAE的琼脂糖凝胶电泳来估计扩增的ep-PCR产物。
使用色谱柱纯化试剂盒纯化产品。通过测量260纳米处的吸光度来估计纯化产物的浓度。真空浓缩ep-PCR产物，以获得等于或大于100纳克/微升的产物浓度。
建立体外RNA合成反应，并将其置于37摄氏度下孵育。然后使用柱纯化试剂盒纯化合成产物。根据制造商的建议，通过添加大约 1 微克的病毒 RNA、5 微摩尔反向引物和 200 个单位的逆转录酶来建立 20 微升的 cDNA 合成反应。
使用cDNA，按照文本手稿中的描述制备反应混合物，并运行扩增循环。在基于0.8%TAE的琼脂糖凝胶上运行产物以确认25个71碱基对的产物大小，然后如前所述使用柱纯化试剂盒纯化产物。在 40 微升无菌水中洗脱。
要添加三个 Prime A 突出端，加入 0.5 微摩尔 DATP 和 1 个单位的低保真 Taq DNA 聚合酶，并将整个 PCR 产物在 70 摄氏度下孵育 30 分钟，以及 1X PCR 缓冲液和 1.5 毫摩尔氯化镁。然后使用色谱柱纯化试剂盒纯化混合物。设置连接反应，并在室温下孵育三小时。
然后向连接的DNA中加入100微升大肠杆菌DH5-Alpha，并在42摄氏度下对细胞进行热休克35秒。向细胞悬液中加入一毫升LB培养基，并在37摄氏度下轻轻摇动孵育1小时。离心机为13,800 RCF。
弃去上清液，重悬于200μL新鲜LB培养基中。将 100 微升转化的大肠杆菌 DH5-Alpha 细胞接种在含有 50 微克/毫升氨苄青霉素的 LB 板上，并在 37 摄氏度下孵育 16 小时。在含有每毫升氨苄青霉素 50 微克的 5 毫升 LB 培养基中建立 25 至 30 个菌落的小型制备物，并在 37 摄氏度下生长过夜。
第二天，用商业试剂盒提取质粒，并用200纳克分离的质粒、两个单位的EcoR1和所有菌落的1X限制性缓冲液进行10μL体积的限制性内切酶消化。将消化混合物在 37 摄氏度下孵育 3 小时后，将产物加载到 0.8%TAE 基琼脂糖凝胶上以确认质粒 DNA 插入。使用推荐的引物对 25 个阳性克隆的质粒进行 Sanger 测序。
转染前一天，分裂细胞，并使用血细胞计数器计数活细胞数。然后将人肝癌 7.5 细胞接种在 35 毫米培养皿中，放入 2 毫升完全 DMEM 中，并在 37 摄氏度下将细胞在含有 5% 二氧化碳的湿润培养箱中孵育 16 小时。第二天，通过将 10 微升转染试剂稀释在 50 微升最低必需培养基中来制备转录脂质复合物，并在 50 微升最低必需培养基中分别稀释 5 微克病毒转录物。
将两种混合物在室温下孵育 10 分钟。然后将它们混合在单个无菌微量离心管中，并在室温下孵育混合物 30 分钟。细胞孵育后，取出培养基，用预热的 1X PBS 洗涤细胞两次，并加入 1.5 毫升最低必需培养基。
慢慢加入复合物，轻轻旋转培养皿以均匀分布。将细胞在 37 摄氏度下用 5% 二氧化碳孵育 10 小时。然后取出介质。
用一毫升预热的 1X PBS 洗涤转染细胞两次，并加入两毫升完全 DMEM。使用病毒 RNA 分离试剂盒从 140 μL 培养上清液中分离病毒 RNA。使用商业 qRT-PCR 试剂盒建立 10 μL qRT-PCR 反应。
使用正向和反向引物和探针进行HCV RNA定量。将反应循环设置为 48 摄氏度 20 分钟，95 摄氏度 10 分钟，以及 45 个 95 摄氏度 15 秒和 60 摄氏度 1 分钟的循环。运行反应，并设置阴性对照。
同时，使用十倍连续稀释的已知拷贝数的HCV转录本生成标准曲线，以量化病毒RNA。一式三份。将人肝癌 7.5 细胞铺在 96 孔板中，并在加入病毒前约 16 小时将细胞在 37 摄氏度的 5% 二氧化碳培养箱中孵育。
在生物安全 II 类柜中，对病毒进行 10 倍的连续稀释。每孔加入 100 微升稀释的病毒以感染细胞，并在 37 摄氏度下用 5% 二氧化碳孵育。三天后，用0.1毫升PBS洗涤感染细胞三次，并用0.1毫升冰冷甲醇在零下20摄氏度下固定和透化细胞20分钟。
用 1X PBS 洗涤孔三次，然后用 PBST 洗涤 1 次。去除PBST后，在室温下用0.1毫升含有0.2%脱脂牛奶的1%BSA在PBST中封闭细胞30分钟。除去封闭溶液，用 0.1 毫升在 1X PBS 中制备的 3% 过氧化氢处理细胞 5 分钟。
再次，用 1X PBS 洗涤细胞两次，用 PBST 洗涤 1X。每孔加入 50 微升抗 NS5A 9E10 单克隆抗体，并在室温下孵育 1 小时。用1X PBS洗涤孔三次，用PBST洗涤一次。
每孔加入 50 μL HRP 偶联山羊抗小鼠二 IgG，在室温下孵育 30 分钟，然后用 0.1 毫升 1X PBS 洗涤孔去除未结合的抗体。加入 30 微升 DAB，并在室温下轻轻摇动孵育板 10 分钟。取出DAB溶液，用1X PBS洗涤孔两次，用蒸馏水洗涤一次。
加入 100 微升含有 0.03% 叠氮化钠的 PBS。使用10X物镜在倒置光学显微镜下检查每个孔。计算阳性孔的数量。
使用Reed和Muench计算器估计感染50%孔的终点稀释度。将 NS5A 抑制剂 pibrentasvir 溶解在 100%DMSO 中至一毫摩尔浓度，并在完全 DMEM 中进一步稀释至 10 纳摩尔浓度。然后以 70% 的汇合度感染幼稚的 Huh-7.5 细胞，用 ML50 病毒剂量感染 50% 的细胞 12 小时，然后在感染后 24 小时将感染的细胞转移到六孔板上。
细胞分裂 16 小时后，向感染细胞中加入 1X EC50 PIB。在每个细胞分裂六次连续传代后进行此操作，然后是三个无药物传代循环，并使用焦点形成测定法监测病毒传播。在每次传代时收获病毒上清液，并储存在零下80摄氏度。
在第 18 天从上清液中提取病毒 RNA 并合成 cDNA。使用 5 微升稀释的 cDNA 扩增 NS5A 基因。然后使用 NS5A 测序引物测定 6 至 8 个阳性细菌质粒中的 NS5A 耐药突变。
使用克隆 pJFH1 合成全基因组突变文库，数量从 100 纳克减少到 10 纳克。ep-PCR产物的平均产量范围为每微升3.8至12.5纳克。突变文库中的突变比例随着ep-PCR反应中pJFH1输入的减少而增加。
使用 50 纳克模板合成的 ML50 每复制 10， 000 个碱基对有 4 个取代，而使用 25 纳克模板合成的 ML25 含有 9 个取代。在克隆pJFH1中，测序的核苷酸数量内未发现取代。与克隆性 JFH1 病毒相比，ML50 病毒变体对 pibrentasvir 的敏感性较低。
在8个NS5A无性系中，有4个有D7V+F28C的组合，而V8A+F28C和F36L各有1个无性系。这些突变位于 NS5A 的 N 末端区域，已知该区域含有临床相关的 NS5A 耐药突变。ep-PCR中每种组分的最终浓度至关重要，尤其是模板量。
缺少KB扩展剂将大大降低ep-PCR产物的产量。
