该协议描述了转基因斑马鱼幼虫如何可用于提供肿瘤异种血管化的体内定量测定。与以前的技术相比，该技术的主要优点是，它允许研究者准确量化异种血管化水平的变化。关键步骤是确保肿瘤细胞正确注射到斑马鱼幼虫中，以便随后的成像和定量步骤不会受到影响。
在生长和标记B16-F1细胞与荧光染料后，开始准备胚胎植入。在E3溶液中用2%的甲基纤维素填充35毫米的盘子，达到盘子体积的四分之一。使用转移移液器，将大约 50 个以前准备的转基因胚胎放在甲基纤维素上，同时最大限度地减少 E3 溶液的转移量。
使用微胶囊移液器尖端，排列胚胎，使胚胎都垂直方向，头朝上，尾到底部，胚胎的左侧朝上。将 50% ECM 添加到先前准备的 B16-F1 细胞颗粒中，以 2 比 1 的比例将细胞混合物与 ECM 混合。通过移液和搅拌混合良好，将混合物储存在冰上。
使用微胶囊移液器，以产生3至10微升的细胞。小心地将移液器尖端插入先前准备的微注射针中，然后将 B16-F1 基质混合物喷射到针头末端。将针头插入针架，以 45 度角向盘倾斜。
使用钳子打破针头，使一个足够大的孔，使细胞从针头中弹出而不挤压细胞。打开连接到喷射装置的加压气瓶，然后暂时将喷油器打开连续模式不超过一秒钟，将电池推到针尖。将针头指向胚胎的蛋黄囊，并朝腹向推过蛋黄囊，直到针尖从蛋黄囊中出现，并推动胚胎腹侧的胚胎表皮，只是后部的心脏。
小心和稍微向前推针尖，直到它在表皮和蛋黄囊膜之间创造了一个小空间。脉冲喷油器将部分细胞混合物喷射到此边缘空间。仔细查看植入异种移植体的大小、形状和位置，并相应地调整针头的脉冲数和位置，以确保正确植入异种移植。
重复脉冲，直到将500到800个细胞注入边缘空间，形成可见的凸起，至少沿着蛋黄囊底部延伸一半。从胚胎上取出针头。注射所有胚胎后，使用微胶囊移液器尖端将所有胚胎推在一起，以便它们能尽可能少地用甲基纤维素移出。
将胚胎移植到含有E3的恢复盘中，配以PTU和甲基蓝。然后轻轻移液器E3周围的胚胎洗涤，然后在34摄氏度下孵育。然后用共和显微镜对被麻醉的胚胎进行成像。
使用适合肿瘤细胞的激光通道来确定要成像的体积，允许移植物两侧的至少一个或两个光学部分。使用相距约 5 微米的剖面间隔创建 Z 堆栈。使用双通道成像成像血管和肿瘤异种移植。
对一个幼虫的肿瘤异种移植和血管进行成像，并重复这些步骤，让每个幼虫都进行成像。首先对斑马鱼异种移植的血管基因反应进行定量，将以前创建的 Z 堆栈异种动物共生图像文件传输到 3D 图像分析软件上的新文件夹。若要创建用于测量肿瘤异种体积的肿瘤体积协议，请转到窗口顶部菜单上的"测量"选项卡，然后从显示的协议列表中将名为"查找对象"的协议拖动到名为"在此处拖动任务以进行测量"的空间。
确保此协议设置为测量肿瘤通道中的对象后，将名为"剪辑到 ROI"的协议从协议列表中的"从人口中"进行 ROI 从"拖取任务"到"在此处执行测量"空间，确保这两个命令适用于"查找对象"标识的对象。在校准此协议的设置之前，请转到窗口左上角的"模式"标签上方的下拉菜单，然后选择"扩展焦点"视图。通过单击每个通道标题下方的黑圈，取消选择最右侧窗格中的非肿瘤通道，以便只能看到肿瘤通道。
然后使用窗口顶部的"手绘"工具，在所有肿瘤体积周围绘制感兴趣的区域或 ROI。在图像下方的面板中，选择"摘要"标签，然后设置"显示"选项以显示人口 2。要校准，在"查找对象"任务中，单击星号以打开设置窗口。
使用强度调整阈值，并确定较低的阈值，直到只选择肿瘤细胞，而不是背景荧光。通过将最小对象大小设置为 100 立方微米，确定最小对象大小，以便只测量完好无损的细胞，而不是较小的细胞碎片。单击顶部菜单上的"测量"选项卡并单击"保存协议"，将此协议另存为肿瘤卷。
使用相同的设置来测量所有异种移植。要测量异种移植相关血管的体积，请通过进入顶部菜单，然后单击"测量"选项卡，然后清除协议来创建新协议。将"查找对象"和"剪辑到 ROIS"任务拖动到标题为"在此处拖动任务以对此协议进行测量"的空间中。
确保将第一个命令设置为测量血管通道中的对象，并且以下命令设置为应用于第一个命令标识的对象。然后取消选择极右窗格中的非血管通道，以便只能看到血管。以与前面描述的肿瘤卷协议类似的方式确定容器卷协议的设置，并保存此协议为容器卷。
清除协议，并围绕异种移植绘制 ROI，注意不要包括任何非肿瘤自荧光。要测量此 ROI 内肿瘤通道中对象体积的总和，请单击"测量"选项卡，选择"还原协议"命令，选择肿瘤体积协议，然后单击"还原"。使用 Tumor 体积协议提供的新 ROI，单击"测量"选项卡并选择"还原协议"命令，选择"容器体积协议"，然后单击总和行以计算此 ROI 内容器通道中的对象总量。
将血管体积除以肿瘤体积，将答案乘以100，以获得移植血管化的百分比值。通过成像植入后6小时、24小时和48小时的个体异种移植，可以计算不同时间点的血管原源反应，最大血管原反应在植入后24至48小时之间，移植血管化的最高水平在48小时左右。植入受精后两天的B16-F1异种移植体共声延时成像显示，GFP标记的血管通过异种移植生长，形成一个扭曲网络，血管大小不规则，形态异常，在哺乳动物肿瘤中出现典型的异常血管网络。
在 VEGFR 抑制剂中孵育的异种移植物与在 DMSO 中孵育的控制异种移植物相比，具有很大的容器减少量。在控制胚胎中，有一个广泛的血管网络，横跨整个异种移植区域，这是植入B16-F1细胞后观察到的典型血管原反应。当量化时，血管原反应显示与对控组相比，VEGFR抑制剂治疗的异种移植物的移植血管化明显减少。
肿瘤通道显示一质量的B16-F1细胞荧光标记下方的蛋黄囊，显示自动荧光。因此，必须仔细绘制一个投资回报率周围的异种，注意不要包括任何自荧光从蛋黄囊。肿瘤体积协议识别了 ROI 中的所有 B16-F1 细胞，测量了其体积，并将 ROI 剪裁到其体积。
肿瘤容器体积协议在这个新的剪切投资回报率允许识别所有与B16-F1细胞质量相关的容器，并测量其体积。肿瘤体积和肿瘤体积协议的值可用于测量移植血管化。斑马鱼的遗传可伸缩性和渗透性允许对肿瘤血管生成中高信号通路的调查，它也可以作为识别抗血管生成化合物的筛选平台。
