פרוטוקול זה מתאר כיצד זחלי זברה מהודרים יכולים לשמש כדי לספק התזה כמותית של vivo של כלי דם קסנוגרפט הגידול. היתרון העיקרי של טכניקה זו על פני טכניקות קודמות הוא שהיא מאפשרת לחוקר לכמת במדויק שינויים ברמות של כלי דם קסנוגרפט. הצעד העיקרי הוא להבטיח כי התאים הגידול מוזרקים כראוי לתוך זחלים זברה, כך הדמיה לאחר מכן צעדים כימות אינם בסכנה.
לאחר גידול ותיוג תאי B16-F1 עם צבע פלואורסצנטי, התחל להכין עוברים להשתלה. מלאו מנה של 35 מ"מ בתת פתרון 2%methylcellulose ב-E3 לרבע מנפח המנה. באמצעות פיפטה העברה, למקם כ 50 עוברים מהוכנו בעבר על methylcellulose תוך מזעור נפח פתרון E3 הועבר.
בעזרת קצה פיפטה מיקרו-אפילרי, מסדרים את העוברים כך שכולם מכוונים אנכית עם ראשיהם למעלה, זנבות לתחתית, ועובר עם צד שמאל למעלה. הוסף 50%ECM לכדור תא B16-F1 שהוכן בעבר כדי לייצר תערובת של תאים ל- ECM ביחס של שניים לאחד. מערבבים היטב על ידי צינורות ומערבבים, ולאחסן את התערובת על קרח.
השתמש פיפטה microcapillary לקחת עד שלושה עד 10 microliters של תאים. בזהירות להכניס את קצה פיפטה לתוך מחט microinjection שהוכן בעבר, ולאחר מכן להוציא את תערובת מטריצת B16-F1 לתוך סוף המחט. הכנס את המחט למחזיק המחט, והטה בזווית של 45 מעלות לצלחת.
השתמש פינצטה כדי לשבור את קצה המחט כדי להפוך חור גדול מספיק עבור התאים להיפלט מן המחט מבלי לסחוט את התאים. הפעל את גליל האוויר בלחץ המחובר למנגנוני ההזרקה, ולאחר מכן הפעל לרגע את המזרק במצב רציף למשך לא יותר משנייה אחת כדי לדחוף את התאים לקצה המחט. כוון את המחט לכיוון שאק החלמון של העובר, ודחוף אותה דרך שאק החלמון לכיוון הגחוני עד שטיפ המחט יצא משק החלמון ודוחף את האפידרמיס העוברי בצד הגחוני של העובר, רק אחורי ללב.
בזהירות ומעט לדחוף את קצה המחט קדימה עד שהוא יצר רווח קטן בין האפידרמיס ואת קרום החלמון. פולסים את המזרק כדי להוציא חלק מתערובת התאים לחלל הצפק הזה. בזהירות להסתכל על הגודל, הצורה, ואת המיקום של xenograft כפי שהוא מושתל, ולהתאים את מספר הדופק ואת המיקום של המחט בהתאם כדי להבטיח xenograft מושתל כראוי.
חזור על הפולסים עד 500 עד 800 תאים הוזרקו לתוך החלל perivitelline, יצירת בליטה גלויה המשתרעת לפחות מחצית הדרך לאורך החלק התחתון של שקי החלמון. הסר את המחט מהעובר. לאחר הזרקת כל העוברים, השתמש קצה פיפטה microcapillary לדחוף את כל העוברים יחד, כך שהם יכולים להיות pipetted החוצה עם כמה שפחות methylcellulose ככל האפשר.
מעבירים את העוברים לצלחת התאוששות המכילה E3 עם PTU וכחול מתילן. ואז בעדינות פיפטה E3 סביב העוברים לשטוף אותם, ולאחר מכן דגירה ב 34 מעלות צלזיוס. ואז תמונה עוברים הרדמה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקל.
השתמש בערוץ לייזר המתאים לתאי הגידול כדי לקבוע נפח להדמיה, המאפשר לפחות חלק אופטי אחד או שניים משני צדי השתל. השתמש במרווחי מקטעים שהם בערך חמישה מיקרומטרים זה מזה כדי ליצור מחסנית Z. השתמש בהדמיה דו-ערוצית כדי לדמיין הן את כלי הדם והן את קסנוגרפט הגידול.
תמונה קסנוגרפט הגידול וכלי הדם עבור זחל אחד, ולחזור על צעדים אלה עבור כל זחל להיות בתמונה. כדי להתחיל עם כימות של התגובה האנגיוגנית xenograft זברה, העברה שנוצרה בעבר Z מחסנית confocal קבצי תמונה של קסנוגרפט גידול לתיקיה חדשה על תוכנת ניתוח תמונה 3D. כדי ליצור את פרוטוקול נפח הגידול למדידת נפח xenograft הגידול, עבור אל הכרטיסיה מדידה בתפריט העליון של החלון ולאחר מכן מרשימת הפרוטוקולים המופיעים גרור את הפרוטוקול בשם חפש אובייקטים לחלל שכותרתו גרור משימות כאן כדי לבצע מדידות.
לאחר שתוודא שפרוטוקול זה מוגדר למדידת אובייקטים בערוץ הגידול, גרור את הפרוטוקולים הנקראים גזור להדרה (ROIs) והפוך את ההשקעה מהאוכלוסייה לרשימת הפרוטוקולים למרחב גרור משימות כאן כדי לבצע מדידות, וודא ששני פקודות אלה חלות על האובייקטים שזוהו על-ידי חיפוש אובייקטים. לפני כיול ההגדרות של פרוטוקול זה, עבור לתפריט הנפתח שמעל לתווית Mode בחלק הימני העליון של החלון ובחר בתצוגת מיקוד מורחב. בטל את הבחירה בערוצים שאינם גידולים בחלונית בצד ימין על ידי לחיצה על העיגול השחור מתחת לכל כותרת ערוץ, כך שניתן יהיה לראות רק את ערוץ הגידול.
לאחר מכן השתמש בכלי Freehand בחלק העליון של החלון כדי לצייר אזור עניין, או ROI, סביב כל נפח הגידול. בחלונית שמתחת לתמונה, בחרו בתווית Summary ולאחר מכן קבעו את האפשרות 'תצוגה' להצגת אוכלוסיה 2. כדי לכייל, במשימה חיפוש אובייקטים, לחץ על כוכבית כדי לפתוח את חלון ההגדרות.
התאימו את הסף בעוצמה, וקבעו את הסף התחתון עד שרק תאי הגידול ייבחרו ולא פלואורסצנטיות הרקע. קבע את גודל האובייקט המינימלי כך שרק תאים שלמים יימדדו, בניגוד לפריטים קטנים יותר של פסולת תאים, על-ידי הגדרת גודל האובייקט המינימלי כ- 100 מיקרומטר מעוקב. שמור פרוטוקול זה כאמצעי אחסון לגידולים על-ידי לחיצה על הכרטיסיה מדידות בתפריט העליון ולחיצה על שמור פרוטוקול.
השתמש באותן הגדרות למדידת כל xenografts. כדי למדוד את עוצמת הקול של כלי הדם הקשורים xenograft, ליצור פרוטוקול חדש על ידי הולך לתפריט העליון ולאחר מכן לחיצה על הכרטיסייה מדידות ולאחר מכן נקה פרוטוקול. גרור את המשימות חפש אובייקטים וגזור ל- ROIs לתוך השטח שכותרתו גרור משימות לכאן כדי לבצע מדידות עבור פרוטוקול זה.
ודא שהפקודה הראשונה מוגדרת למדידת עצמים בערוץ כלי הדם ושפקודתה הבאה מוגדרת להחיל על האובייקטים שזוהו על-ידי הפקודה הראשונה. לאחר מכן בטלו את הבחירה בת ערוצי כלי השיט בחלונית השמאלית הקיצונית, כך שניתן יהיה לראות רק את כלי הדם. קבע את ההגדרות עבור פרוטוקול אמצעי האחסון של כלי הדם באופן דומה לפרוטוקול נפח הגידול שתואר קודם לכן, ושמור פרוטוקול זה כאמצעי אחסון לכלי קיבול.
לנקות את הפרוטוקול, ולצייר ROI סביב xenograft, דואג לא לכלול כל שפעת אוטומטית שאינה גידול. כדי למדוד את עוצמת הקול של האובייקטים בערוץ הגידול בתוך ROI זה, לחץ על הכרטיסיה מדידות, בחר בפקודה שחזר פרוטוקול, בחר בפרוטוקול אמצעי אחסון של גידול ולחץ על שחזר. באמצעות ערך ההשקעה החדש שבוצע על-ידי פרוטוקול נפח הגידול, לחץ על הכרטיסיה מדידות ובחר בפקודה שחזר פרוטוקול, בחר בפרוטוקול אמצעי אחסון של כלי קיבול ולחץ על שורת הסכום כדי לחשב את הנפח הכולל של אובייקטים בערוץ כלי הדם בתוך ערך דיסק זה.
לחלק את נפח הכלי על ידי נפח הגידול, ולהכפיל את התשובה על ידי 100 כדי לקבל ערך אחוז של כלי דם השתל. על ידי הדמיה של קסנוגרפט בודד בשש, 24 ו-48 שעות לאחר ההשתלה, ניתן לחשב את התגובה האנגיוגנית בנקודות זמן שונות, עם התגובה האנגיוגנית הגדולה ביותר בין 24 ל -48 שעות לאחר ההשתלה והרמות המרביות של כלי דם של שתלים שנראו בסביבות 48 שעות. הדמיה מוקדמת של קסנוגרפט B16-F1 שהושתל בעובר זברה-דג לאחר הפריה של יומיים מראה כלי דם בעלי תווית GFP הגדלים דרך קסנוגרפט, ויוצרים רשת מפותלת עם כלי גודל ומורפולוגיה לא סדירים האופייניים לרשת כלי הדם הלא תקינה שנראתה בגידולים של יונקים.
Xenografts דגירה מעכבי VEGFR להראות הפחתת כלי גדול לעומת שליטה xenografts דגירה DMSO. בעוברים בקרה, הייתה רשת כלי דם רחבת ידיים המשתרעת על פני כל אזור קסנוגרפט, התגובה האנגיוגנית האופיינית שנצפתה לאחר השתלת תאי B16-F1. כאשר כימת, תגובה אנגיוגנית מראה ירידה ברורה כלי דם השתל ב xenografts מעכבי VEGFR מטופלים בהשוואה לפקדים.
ערוץ הגידול מראה מסה של תאי B16-F1 המסווים באופן פלואורסצנטי מתחת לשאק החלמון, המציג שפעת אוטומטית. לכן, יש לצייר בזהירות את ההשקעה סביב xenograft, דואג לא לכלול את כל שפעת אוטומטית מן המקום חלמון. פרוטוקול נפח הגידול זיהה את כל תאי B16-F1 בהפרעה על ההשקעה, מדד את נפחם וקיצץ את ההשקעה בנפח שלהם.
פרוטוקול נפח כלי הגידול בהפרעה על ההשקעה החדשה הזו איפשר זיהוי של כל הכלים הקשורים למסה של תאי B16-F1 ומדד את נפחם. הערכים מנפח הגידול ופרוטוקולים נפח כלי הגידול ניתן להשתמש כדי לתת מידה של כלי דם השתל. הכדאיות הגנטית והחלחלות של דגי זברה מאפשרות חקירה של מסלולי איתות גבוהים באנגיוגנזה של גידולים, והיא יכולה לשמש גם כפלטפורמת סינון לזיהוי תרכובות אנטי-אנגיוגניות.
