鉴于TEdeff癌症是免疫治疗的一大障碍，我们的药理学模型是一个有利的工具，因为它适当地模仿了此类癌症中观察到的广泛转录和表观遗传缺陷，它允许人们研究这些非遗传异常，以获得新的见解，发现现有药物的新用途，或找到针对此类癌症的新策略。这是一个易于建立和通用的模型，研究癌症的转录伸长缺陷，使一个人能够研究肿瘤-免疫相互作用在体外和体内。该方法也适用于人类癌线。
我们已经在T47D和CAL51上进行了短期测试，从而产生类似的TEdeff特性。我们在这里描述的协议提供了一个基本框架，以最小化通过慢性 CDK9 抑制生成 TEdeff 样功能的关键已知变量。然而，必须注意优化其他穆林线的黄曲二维剂量。
细胞电镀密度、培养条件、细胞因子刺激条件的变化对不同细胞的乳氨酸系的影响可能有所不同。首先使用寡头 dT 磁珠从一半的核糖体 RNA 耗尽样本中提取聚A阳性 RNA。通过涡旋将珠子重新在小瓶中重新发送30秒，然后将200微升的珠子转移到管子中。
添加相等的绑定缓冲区，并将内容混合。将管子放在磁铁中一分钟，然后丢弃上一液。然后，从磁铁上取下管子，将洗涤的珠子重新用100微升的装订缓冲器重新填充。
在pH 7.5下，使用10毫摩尔三叶草-HCl将核糖体RNA耗竭样品的体积调整为100微升。向样本添加 100 微升绑定缓冲区。将混合物加热到65摄氏度两分钟，以破坏二次RNA结构，然后立即将混合物放在冰上。
将总RNA的200微升加入洗涤珠的100微升，在转子上彻底混合5分钟。将管子放在磁铁上一到两分钟，小心地取出所有上流液，然后从磁铁上取下管子，并加入200微升的洗涤缓冲液。小心地混合样品，通过上下移液几次，将管子回磁铁一分钟，然后取出上流液。
然后，使用分光光度计测量分离的珠束mRNA的纯度和浓度。使用核糖体RNA贫化样品的剩余一半作为蛋白质A柱的输入，用单克隆7-甲基瓜诺辛抗体免疫沉淀五质顶RNA。根据制造商的协议，从 RIP 试剂盒中清洗蛋白质 A 磁珠，将 7-甲基瓜氨酸抗体的抗体预结合到试剂盒中悬浮在 100 微升洗涤缓冲液中的珠子上。
在室温下孵育混合物30分钟，同时在低速旋转。然后将管子短暂离心，并放在磁性分离器上。取出并丢弃上流液，然后将管子从磁性分离器上取下，然后用500微升的洗涤缓冲液重新悬浮珠子。
旋转管，短暂离心，并放回磁性分离器上，再次丢弃上流剂。然后，将120纳米核糖体RNA耗竭RNA加入抗体结合珠，连同一个RNAse抑制剂微升，在室温下孵育60至90分钟，并轻度搅拌。孵育后，以300次g旋转样品10秒，然后用未封顶的mRNA将上流液转移到新的微离心管中。
用100微升洗涤缓冲液重复洗涤两次，然后将收集的上一液池。加入300微升尿素解液缓冲液，根据稿稿说明，将混合物加热至65摄氏度，加热至2至3分钟，从而从珠子中分离出带盖的mRNA。将300微升的洗样样品与300微升酚：氯仿：异丙醇，反转混合，离开10分钟。
再次轻轻混合样品，并离心两分钟。小心地将顶层移液到新鲜管中，并丢弃底层。在样品中加入300微升2丙醇和30微升三摩尔醋酸钠，倒置几次，在零下20摄氏度中放入20小时。
孵育后，在4摄氏度下将样品离心10分钟。小心丢弃上一液，并在室温下干燥颗粒五分钟。将颗粒重新在无核酸酶水中，用分光光度计测量RNA的纯度和浓度。
根据手稿方向分离 CD8 阳性细胞，然后在市售的磁性分离系统缓冲液中重新悬浮细胞。每一毫升细胞加入100微升抗体鸡尾酒，并在冰上孵育细胞15分钟。然后，每100微升抗体鸡尾酒加入100微升磁珠，将细胞留在冰上再加15分钟。
孵育后，在细胞中加入7毫升的磁分离缓冲液，在新鲜管子中加入3至4毫升，并将管子放在磁性上5分钟。用CD8阳性细胞将液体放在冰上的新鲜管子上。然后，将剩余的三到四毫升细胞添加到磁珠中，并将管子放在磁铁上五分钟。
第二批CD8阳性细胞第一批被分管。种子工程粘附剂SSAMBOK细胞与共刺激分子一起，在24孔板中每井7.5万个细胞，在37摄氏度、5%的二氧化碳加湿培养箱中培养它们。24 小时后，用 Iscove 的改性 Dulbecco 介质清洗 APC 单层一次，并在两毫升的介质中加入 0.5 倍 10 的介质，根据手稿方向补充。
培养细胞20小时，然后通过收集培养介质和在191次g下对细胞进行两分钟的造粒，轻轻收获非吸维OT-I细胞。计算细胞数，并在与B16/F10、未经治疗的B16/F10-OVA和B16/F10-OVA细胞的基培养中以1比1的比例播种。在37摄氏度、5%的二氧化碳加湿培养箱中培养细胞20小时，然后取出OT-I CD8阳性细胞，清洗PBS中的粘附物B16/F10-OVA细胞。
用三普辛在05%EDTA中对三组附着细胞进行五分钟的试制，然后在191次g下将其分粒5分钟。用活力染料和相关标记抗体在冷PBS中孵育收获的B16/F10-OVA细胞，然后用流动细胞学分析其生存能力。该协议已用于建立转录伸长缺陷细胞模型，该模型显示RNA聚合酶II的C-终端重复域上的血清素2位置的磷酸化严重损失，H3K36me3显著减少，这与定义外向边界和抑制失控的神秘转录有关。
这些细胞显示关键的mRNA处理缺陷，其不当封盖和非多聚体多边形MRNA的比例增加。此外，在此细胞模型中观察到关键炎症反应途径基因和FasL培养细胞死亡的特定抑制。一项探索性检测，以测试细胞模型是否具有对细胞毒性T细胞攻击的抵抗力，表明慢性松弛素诱导的转录伸长缺陷可以赋予一种逃避抗肿瘤免疫攻击的手段。
经过氟皮利多治疗的B16/F10细胞稳定过度表达OVA基因不易受到CD8阳性细胞毒性T细胞的影响，这些细胞对OVA表达细胞有选择性毒性。未预处理的弗拉沃皮利多细胞经历了主要细胞死亡，而不表达OVA抗原的亲亲B16/F10存活下来。重要的是要记住，在25纳米摩尔松丙醇治疗中，磷酸素2和H3K36三甲基化水平的降低并不能保证phopsho-STAT1和磷-NF-kappab水平的降低。
每一个小鼠癌线是独一无二的，和JAK1和CCNT1可以挽救的松弛性的影响。此外，该模型可用于体内监测特杰夫癌症对先天和适应性抗肿瘤免疫反应的抵抗力。例如，抗亚卡罗疗法可用于调节NK细胞的活性，免疫检查点治疗可用于TEdeff肿瘤小鼠。
肿瘤渗透淋巴细胞，或蒂尔，负荷是免疫治疗成功的指标。我们的模型为我们探索TEdef癌症微环境中TIL在免疫治疗之前和之后激活和耗尽的程度铺平了道路。
