TEdeffがんが免疫療法に対する重要な障害であることを考えると、当社の薬理学的モデルは、このような癌で観察される広範な転写およびエピジェネティック欠陥を適切に模倣し、これらの非遺伝的異常を研究して新しい洞察を得たり、既存の薬物の新しい用途を見つけたり、そのような癌に対する新しい戦略を見つけることができるので、有利なツールです。これは、がんの転写伸長欠損を研究するための容易で一般化可能なモデルであり、インビトロとインビボの両方で腫瘍免疫相互作用を研究することを可能にする。この方法は、ヒト癌株にも適用することができる。
T47DとCAL51で短期間テストを行い、同様のTEdeffのような特性を生み出しました。ここで説明するプロトコルは、慢性CDK9阻害によるTEdeff様特徴の生成に重要な既知の変数を最小限に抑えるための基本的なフレームワークを提供する。しかし, 他のマウスラインのフラボピリドールの正確な亜死量を最適化するために注意する必要があります。.
細胞めっき密度の変動の影響、培養条件、サイトカイン刺激条件は、異なる細胞マウス株に応じて変化し得る。オリゴdT磁気ビーズを使用して、以前リボソームRNA枯渇サンプルの半分からポリA陽性RNAを抽出することから始めます。バイアル内のビーズを30秒間ボルテックスして再懸濁し、200マイクロリットルのビーズをチューブに移します。
同じ量のバインド バッファを追加し、内容を混ぜます。チューブを磁石に1分間入れ、上清を捨てます。次いで、マグネットからチューブを取り出し、洗浄したビーズを100マイクロリットルの結合バッファーに再懸濁した。
リボソーム RNA で枯渇したサンプルの体積を 100 マイクロリットルに調整し、pH 7.5 で 10 ミリモルトリス-HCl を使用します。100マイクロリットルの結合バッファーをサンプルに加えます。混合物を摂氏65度に2分間加熱して二次RNA構造を破壊し、すぐに氷の上に置きます。
洗浄されたビーズの100マイクロリットルにRNAの合計200マイクロリットルを加え、ローターで5分間十分に混ぜます。チューブをマグネットに1~2分間置き、慎重にすべての上清を取り出し、マグネットからチューブを取り出し、200マイクロリットルの洗浄バッファーを加えます。サンプルを数回上下にピペットして慎重に混ぜ、チューブを磁石に1分間戻し、上清を取り除きます。
次いで、分光光度計を用いて、単離されたビーズ結合mRNAの純度および濃度を測定する。リボソームRNA枯渇サンプルの残りの半分をプロテインAカラムへの入力として使用し、モノクローナル7-メチルグアノシン抗体を有する5素数のキャップ付きRNAを免疫沈降させます。メーカーのプロトコルに従ってRIPキットからタンパク質A磁気ビーズを洗浄し、ビーズに抗体を事前結合し、7-メチルグアノシン抗体をビーズに対して100マイクロリットルの洗浄バッファーに懸濁します。
低温で回転しながら、室温で30分間インキュベートします。その後、チューブを短く遠心し、磁気セパレータに置きます。上清を取り出して捨て、次にチューブを磁気セパレータから取り出し、500マイクロリットルの洗浄バッファーでビーズを再懸濁します。
チューブをボルテックスし、遠心分離し、磁気セパレータに戻し、再び上清を捨てます。その後、抗体結合ビーズにリボソームRNAを120ナノグラム加え、RNase阻害剤を1マイクロリットルずつ加え、穏やかな攪拌で60〜90分間室温で混合物をインキュベートします。インキュベーション後、サンプルを300回gで10秒間回転させ、上限のないmRNAを用いた上清を新しいマイクロ遠心チューブに移します。
洗浄バッファーを100マイクロリットルでさらに2回繰り返し、回収した上清をプールします。ビーズからキャップされたmRNAを、原稿の指示に従って調製した300マイクロリットルの尿素溶菌バッファーを加え、混合物を摂氏65度に2〜3分間加熱することによって、ビーズから溶出する。溶出したサンプルの300マイクロリットルをフェノールの300マイクロリットルと組み合わせる:クロロホルム:イソアミルアルコール、反転して混合し、10分間放置します。
サンプルをもう一度軽く混ぜ、遠心分離機を2分間緩やかに混ぜます。最上層を新鮮なチューブに慎重にピペットし、底層を捨てます。サンプルに300マイクロリットルの2-プロパノールと3モル酢酸ナトリウム30マイクロリットルを加え、数回反転し、マイナス20度に20時間入れます。
インキュベーション後、摂氏4度で10分間サンプルを遠心分離します。上清を慎重に捨て、ペレットを室温で5分間乾燥させます。ヌクレアーゼを含まない水中のペレットを再懸濁し、分光光度計でRNAの純度と濃度を測定します。
原稿の方向に従ってCD8陽性細胞を単離し、次いで市販の磁気分離システムバッファー内の細胞を再懸濁させる。1ミリリットルの細胞に100マイクロリットルの抗体カクテルを加え、氷の上で細胞を15分間インキュベートします。その後、抗体カクテル100マイクロリットルごとに100マイクロリットルの磁気ビーズを加え、さらに15分間氷の上に細胞を残します。
インキュベーションの後、細胞に7ミリリットルの磁気分離バッファーを加え、新鮮なチューブに3〜4ミリリットルをアリコートし、チューブを磁気上に5分間置きます。CD8陽性細胞で液体を氷の上の新鮮なチューブにデカントします。次に、残りの3~4ミリリットルのセルを磁気ビーズに加え、マグネット上にチューブを5分間置きます。
CD8陽性細胞の第2バッチを第1のバッチでチューブにデカントする。種子は、24ウェルプレートでウェルあたり75,000細胞で共刺激分子と一緒に付着線維芽細胞を設計し、37°C、5%炭酸加湿インキュベーターで培養した。24時間後、APC単層をIscoveの改変ダルベッコの培地で1回洗浄し、原稿の指示に従って補足される培地の2ミリリットルの6つのナイーブセルに0.5倍の10を加えます。
細胞を20時間培養し、次いで培地を回収し、191回gで細胞を2分間ペレットすることにより、非接着性のOT-I細胞を穏やかに収穫する。細胞を数え、B16/F10、未処理のB16/F10-OVA、およびフラボピリドールで前処理されたB16/F10-OVA細胞との共培養で1対1の比率で播種する。細胞を摂氏37度で20時間培養し、5%炭酸ガスを加湿インキュベーターで培養し、次いでOT-I CD8陽性細胞を除去し、その後、付着性B16/F10-OVA細胞をPBSで洗浄する。
付着した細胞の3つのグループをトリプシンで05%EDTAにトリプシンし、191回gで5分間ペレットします。採取したB16/F10-OVA細胞を生育性染料および関連する標識抗体を用いて冷たいPBSでインキュベートし、次にフローサイトメトリーで生存率を分析する。このプロトコルは、RNAポリメラーゼIIのC末端反復ドメイン上のセリン2位におけるリン酸化の深い損失とH3K36me3の有意な減少を示す転写伸長欠陥細胞モデルを確立するために使用され、これはエキサポン境界の定義および暴走不可解な転写の阻害に関係する。
細胞は、不適切にキャップされたmRNAおよび非ポリアデニル化mRNAの比率を増加させる重大なmRNA処理欠陥を示す。さらに、主要な炎症反応経路遺伝子およびFasL媒介細胞死の特異的抑制が、この細胞モデルにおいて観察される。細胞モデルが細胞傷害性T細胞攻撃に対する耐性を与えるかどうかをテストする探索的アッセイは、慢性フラボピリアイドル誘発転写伸長欠陥が抗腫瘍免疫攻撃からの脱出手段を与えることができることを示している。
OVA遺伝子を安定的に過剰発現するフラボピリドール処理B16/F10細胞は、OVA発現細胞に対して選択的毒性を有するCD8陽性細胞傷害性T細胞の影響を受けにくい。フラボピリドールで前処理されなかった細胞は大きな細胞死を経験し、OVA抗原を発現しない親B16/F10は生存した。25ナノモルフラボピリドール処理におけるホスホセリン2およびH3K36トリメチル化レベルの低下は、phopsho-STAT1およびホスホ-NF-κBレベルの両方の低下を保証しないことを覚えておくことが重要です。
各マウス癌の線は独特であり、JAK1およびCCNT1はフラボピリドールの効果を救うかもしれない。さらに、このモデルは、先天性および適応性抗腫瘍免疫応答に対してTEdeff癌によって提供される耐性を監視するために生体内で使用することができる。例えば、抗アシアロ治療はNK細胞の活性を調節するために使用することができ、免疫チェックポイント療法はTEdeff腫瘍を持つマウスに投与することができる。
腫瘍浸潤性リンパ球(TIL)負荷は、免疫療法の成功の指標です。私たちのモデルは、免疫療法の前後のTEdeffがん微小環境におけるTLの活性化と疲労の程度を探求する道を開きました。
