בהתחשב בכך שדורת TEdeff היא מחסום משמעותי נגד אימונותרפיה, המודל הפרמקולוגי שלנו הוא כלי יתרון מכיוון שהוא מחקה באופן מתאים את הפגמים התמלוליים והאפיגנטיים הנפוצים שנצפו בסרטן כזה, והוא מאפשר ללמוד את החריגות הלא גנטיות האלה כדי לקבל תובנות חדשות, למצוא שימושים חדשניים לתרופות קיימות, או למצוא אסטרטגיות חדשות נגד סרטן כזה. זהו מודל קל להקמה וניתן להכללה לחקר מומים בהארכת שעתוקים בסרטן, המאפשר ללמוד אינטראקציות בין גידולים חיסוניים הן במבחנה והן במבחנה. שיטה זו יכולה להיות מיושמת גם על קווי קרצינומה אנושית.
בדקנו את זה על T47D ו CAL51 לטווח קצר, מעורר מאפיינים דומים דמויי TEdeff. הפרוטוקול שאנו מתארים כאן נותן מסגרת בסיסית כדי למזער את המשתנים הידועים קריטיים עבור הדור של תכונות כמו TEdeff על ידי עיכוב CDK9 כרוני. עם זאת, יש לדאוג כדי לייעל את המינון התת-קטלני המדויק של flavopiridol עבור קווי מורין אחרים.
ההשפעה של וריאציה בצפיפות ציפוי התא, תנאי תרבות, תנאי גירוי ציטוקיני עשוי להשתנות עבור קווים שונים מורין התא. התחל על ידי חילוץ RNA חיובי פוליA ממחצית הדגימות RNA ריבוזומלי בעבר מדולדל באמצעות חמרוזים מגנטיים oligo dT. תעבירו את חרוזים בבקבוקון על ידי מערבולת למשך 30 שניות, והעברו 200 מיקרוליטרים של חרוזים לצינור.
הוסף אמצעי אחסון שווה של מאגר איגוד וערבב את התוכן. מניחים את הצינור במגנט לדקה אחת, ומשליכים את העל-טבעי. לאחר מכן, להסיר את הצינור מן המגנט, ולתלות מחדש את חרוזים שטף ב 100 microliters של חיץ מחייב.
כוונן את עוצמת הקול של המדגם המדולדל של RNA ריבוזומלי ל-100 מיקרוליטר עם טריס-HCl 10 מילימולרי ב-pH 7.5. הוסף 100 מיקרוליטרים של מאגר איגוד לדגימה. מחממים את התערובת ל-65 מעלות במשך שתי דקות כדי לשבש מבני רנ"א משניים, ומיד מניחים אותה על קרח.
מוסיפים את 200 המיקרוליטרים של ה-RNA הכולל ל-100 המיקרוליטרים של חרוזים שטופים, ומערבבים היטב על רוטור במשך חמש דקות. מניחים את הצינור על המגנט במשך 1 עד 2 דקות, להסיר בזהירות את כל supernatant, ולאחר מכן להסיר את הצינור מן המגנט, ולהוסיף 200 microliters של חיץ כביסה. בזהירות לערבב את המדגם על ידי צינור למעלה ולמטה כמה פעמים, להחזיר את הצינור למגנט במשך דקה אחת, ולהסיר את supernatant.
לאחר מכן, השתמש בספקטרופוטומטר כדי למדוד את הטוהר והריכוז של mRNA חרוז מבודד. השתמשו במחצית הנותרת של הדגימה המרוקנת מ-RNA ריבוזומלית כקלט לחלבון עמודי A כדי להפוך את ה-RNAs עם חמישה ראשים עם נוגדן חד שבטי 7-מתילגואנוסין. לשטוף את החלבון חרוזים מגנטיים מערכת RIP על פי פרוטוקול היצרן כדי לקשור מראש את הנוגדן לחרוזים, של נוגדן 7-מתילגואנוסין לחרוז מושעה ב 100 microliters של חיץ לשטוף מההערכה.
הדגירה את התערובת בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות תוך סיבוב במהירות נמוכה. ואז צנטריפוגה הצינורות בקצרה, ולשים אותם על המפריד המגנטי. מוציאים ומשליכים את העל-טבעי, ואז מוציאים את הצינורות מהמפריד המגנטי, ומוציאים את חרוזים עם 500 מיקרוליטרים של חיץ שטיפה.
מערבולת הצינורות, צנטריפוגה אותם לזמן קצר, והחזר אותם על המפריד המגנטי, ושוב להשליך את העל-טבעי. לאחר מכן, מוסיפים 120 ננוגרם של רנ"א מדולדל RNA ריבוזומלי לקדושים הקשורים לנוגדנים יחד עם מיקרוליטר אחד של מעכב RNase, וולדגר את התערובת בטמפרטורת החדר במשך 60 עד 90 דקות עם תסיסה קלה. לאחר הדגירה, לסובב את המדגם ב 300 פעמים g במשך 10 שניות, ולהעביר את supernatant עם מיפוי לא ממופה לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש.
חזור על לשטוף פעמיים נוספות עם 100 microliters של חיץ לשטוף, ואת הבריכה supernatant שנאסף. אלוט mRNA כתרים מן חרוזים על ידי הוספת 300 microliters של חיץ תזה אוריאה מוכן על פי הוראות כתב היד וחימום התערובת ל 65 מעלות צלזיוס במשך שתיים עד שלוש דקות. שלבו 300 מיקרוליטרים של הדגימה האלוטה עם 300 מיקרוליטרים של פנול:כלורופורם:אלכוהול isoamyl, היפוך לערבב, ולהשאיר במשך 10 דקות.
מערבבים בעדינות את הדגימה שוב, וצנטריפוגה במשך שתי דקות. בזהירות pipette השכבה העליונה לצינור טרי, ולהשליך את השכבה התחתונה. מוסיפים 300 מיקרוליטרים של 2-propanol ו 30 microliters של אצטט נתרן שלוש טוחן לדגימה, להפוך אותו כמה פעמים, ולשים אותו מינוס 20 מעלות צלזיוס במשך 20 שעות.
לאחר הדגירה, צנטריפוגה המדגם במשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. בזהירות להשליך את supernatant, ולייבש את גלולה בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. תן את גלולה במים ללא גרעין, ולמדוד את הטוהר והריכוז של RNA עם ספקטרופוטומטר.
בודד תאים חיוביים CD8 בהתאם לכיווני כתב היד, ולאחר מכן בצע שימוש חוזר בתאים במאגר מערכת ההפרדה המגנטית הזמינה מסחרית. מוסיפים 100 מיקרוליטרים של קוקטייל נוגדנים לכל מיליליטר של תאים, ומדרגים את התאים על הקרח במשך 15 דקות. לאחר מכן, להוסיף 100 microliters של חרוזים מגנטיים לכל 100 microliters של קוקטייל נוגדנים, ולהשאיר את התאים על הקרח עוד 15 דקות.
לאחר הדגירה, להוסיף שבעה מיליליטר של חיץ הפרדה מגנטית לתאים, aliquot שלושה עד ארבעה מיליליטר לצינור טרי, ול מניחים את הצינור על מגנטי במשך חמש דקות. דקאנט הנוזל עם תאים חיוביים CD8 לצינור טרי על קרח. לאחר מכן, מוסיפים את שלושת עד ארבעה מיליליטר הנותרים של תאים לתוך חרוזים מגנטיים, ומ מניחים את הצינור על המגנט במשך חמש דקות.
Decant האצווה השנייה של תאים חיוביים CD8 לצינור עם האצווה הראשונה. זרעים מהונדסים חסידים פיברובלסט SAMBOK תאים יחד עם מולקולת גירוי משותף ב 75, 000 תאים לבא בצלחות 24 באר, ולתרבת אותם 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני לחות אינקובטור. לאחר 24 שעות, לשטוף את מונוליאר APC פעם אחת עם המדיום של Iscove שונה Dulbecco, ולהוסיף 0.5 פעמים 10 לשישה תאים נאיביים בשני מיליליטר של בינוני בתוספת על פי הוראות כתב היד.
תרבות התאים במשך 20 שעות, ואז בעדינות לקצור את תאי OT-I לא עקבי על ידי איסוף התקשורת ו גלולות התאים ב 191 פעמים g במשך שתי דקות. לספור את התאים, ולזרע אותם ביחס של אחד לאחד בתרבות שיתוף עם B16/F10, B16/F10-OVA מטופלים, ותאי B16/F10-OVA מטופלים מראש עם flavopiridol. תרבות התאים במשך 20 שעות ב 37 מעלות צלזיוס, 5%פחמן דו חמצני לחות אינקובטור, ולאחר מכן להסיר את התאים OT-I CD8 חיובי, ולשטוף את התאים חסידי B16/F10-OVA ב PBS.
נסה את שלוש הקבוצות של תאים מחוברים ב 05%EDTA עם טריפסין במשך חמש דקות, ולאחר מכן גלולה אותם ב 191 פעמים g במשך חמש דקות. דגירה B16/F10-OVA שנקטפו בתאי PBS קרים עם צבע הכדאיות ונוגדנים מסומנים רלוונטיים, ולאחר מכן לנתח את הכדאיות עם ציטומטריית זרימה. פרוטוקול זה שימש כדי להקים מודל תא פגום התא התארכות שעתוק המציג אובדן עמוק של זרחון בעמדת סרין 2 על התחום C-מסוף חוזר של RNA פולימראז II וירידה משמעותית H3K36me3, אשר מעורב בהגדרת גבולות exon ועיכוב תעתיקים נסתרים בורח.
התאים מראים פגמים קריטיים בעיבוד mRNA עם יחס הולך וגדל של mRNAs כתרים לא תקינים ולא polyadenylated. יתר על כן, דיכוי ספציפי של גנים מרכזיים במסלול התגובה הדלקתית ומוות תאים מתווך FasL נצפו במודל תאים זה. בדיקה חקרנית כדי לבדוק אם מודל התא מעניק עמידות להתקפה ציטוקקסית של תאי T מראה כי פגמים כרוניים בהארכת שעתוק הנגרמים על ידי flavopiridol יכולים להעניק אמצעי בריחה מהתקפה חיסונית נגד גידולים.
תאי B16/F10 שטופלו בפלאבופירידול בדיכוי יתר של הגן OVA לא היו רגישים לתאי T ציטוקסיים חיוביים ל-CD8, שיש להם רעילות סלקטיבית כלפי תאים מבטאים OVA. תאים שלא טופלו מראש עם flavopiridol עברו מוות תאי גדול, בעוד ההורים B16/F10 כי אינם מבטאים את האנטיגן OVA שרד. חשוב לזכור כי הפחתה ברמת ההקצה של פוספוזרין 2 ו- H3K36 בטיפול פלבופירידול 25 ננו-מולארי אינה מבטיחה הפחתה הן ברמת פופשו-STAT1 והן ברמת פוספו-NF-קאפה-באט.
כל קו קרצינומה של העכבר הוא ייחודי, ו JAK1 ו CCNT1 עשוי להציל את ההשפעה של flavopiridol. בנוסף, מודל זה יכול לשמש vivo כדי לפקח על ההתנגדות המוצעת על ידי סרטן TEdeff נגד תגובות חיסוניות נוגדות גידול המולדת והסתגלות. לדוגמה, טיפולים אנטי אסיה יכול לשמש כדי לווסת את הפעילות של תאי NK, טיפול מחסום החיסון יכול להינתן עכברים נושאי גידול TEdeff.
הלימפוציטים שחודרים לגידולים, או TIL, עומס הוא אינדיקטור להצלחה באימונותרפיה. המודל שלנו סלל לנו את הדרך לחקור את היקף ההפעלה והתשישות של TILs במיקרו-וירוס סרטן TEdeff הן לפני ואחרי אימונותרפיה.
