这种技术对膜运输器的特性的主要优点之一是，您可以确定特定基材的运输器的相对亲和力，并深入了解运输机制。使用蛋白质梯度驱动基质传输的膜蛋白的表征特别适用于我们在此演示的这种从内到外的囊泡测定。虽然这种测定需要一些专门的设备，如法国印刷机和获得超离心剂，但我们认为，从技术上讲，这种检测比需要将膜运输机重组为人造脂质体的检测更容易。
该技术的主要优点是，它使我们能够量化不同基材的相对亲和力，并进行竞争分析，以测试竞争基材对运输格栅的影响。在用于说明此测定的 BAT1 运输机的情况下，我们还能够通过精氨酸显示运输器的基板激活。为了开始这个程序，培养准备好的大肠杆菌突变细胞，通过用适当的抗生素在5毫升聚胺3培养基中接种单个菌落，并在37摄氏度下过夜生长，来表达目标蛋白质。
第二天，将这种培养物转移到500毫升的新鲜聚胺3培养，补充0.0002%的阿拉伯糖，并生长，直到细胞培养达到OD600之间的0.6和0.8。在此之后，离心机在2000倍G和4摄氏度15分钟收集细胞颗粒。重新悬浮颗粒，用缓冲液洗涤三次，每次在2000次G和4摄氏度下离心15分钟。
缓冲区一中第三次旋转后的最终细胞体积应为 10 毫升。设置一个35毫升的法国压力细胞，并倒入细胞的悬浮液到细胞的身体。打开机器，打开设备背面的 RHS 开关，将比率选择器开关设置为高。
打开泵开关。活塞将开始从底座上升，以置换腔室中的空气。顺时针转动压力增加阀，直到仪表达到 640 PSI，以增加压力。
这将产生10，000 PSI的内部压力。一旦电池达到目标压力，通过逆时针转动流动阀组件，稍微打开该阀总成。调整阀门的开口，使流量每分钟只有 10 滴左右。
当活塞体上的止油管到达流水单元顶部时，泵关闭。将比率选择器开关向下放置，然后打开泵开关，降低底板。当底板完全缩回时，通过完全逆时针转动压力增加阀，将系统压力降至零。
关闭泵开关并关闭机器。将法国人的除心机在1万倍G和4摄氏度下离心15分钟，以清除不间断的细胞和细胞碎片。丢弃颗粒，将上流液转移到超离心管中。
超离心在15万倍G和4摄氏度下产生上流水，一小时来颗粒膜囊。在缓冲液二中，在不重新悬浮的情况下清洗膜囊泡一次。然后，使用 Dounce 组织研磨机在缓冲器二中重新悬浮膜囊泡。
在1.5毫升离心管中准备100微升等分膜制剂，并将其储存在零下80摄氏度。首先，在pH 7.8的30毫摩尔中清洗和重新悬浮囊泡，其中含有0.1毫摩尔的钴二氯化物。在每个100微升样品中加入一微升的碳氧培液 A，三氧化二中，
在20摄氏度下孵育20分钟。在PH 7.5中加入含有EDTA钠和2-墨二甲醇溶液的5微升，以阻止消化。在室温下孵育溶液一小时，使酶完全灭活。
接下来，在样品的pH 7.5至100微升下加入5至10微升含有硫酸锂、甘油、溴酚蓝色和Tris的溶液，然后通过电泳分析样品。为了进行氨基印迹，在聚丙烯酰胺凝胶上铺设一个用25毫摩尔磷酸氢钠润湿的硝基纤维素过滤器。将这些放在两个潮湿的纤维素过滤器之间，最后，放在两个潮湿的塑料冲刷垫之间。
在2至4摄氏度的温度下，将这种组合放在含有25毫摩尔磷酸氢钠的腔室的电极之间。电转蛋白质在20伏特和2至3安培三小时。在摄氏2度下，在一夜之间阻断缓冲液中阻断硝基纤维素膜。
第二天，孵育20毫升的硝基纤维素，稀释一至五千剂抗血性C-终端HRP抗体，阻断缓冲液两小时，用50毫升缓冲液洗涤两次，共60分钟。为了可视化氨基印迹，将6毫克4-1-纳普托霍尔溶解在20毫升变性酒精中，并加入80毫升15毫摩尔三酯和50微升30%过氧化氢。在此基板溶液中将滤纸洗洗 20 分钟。
当颜色足够时，用水冲洗膜，让其干燥。首先，在12摄氏度下孵育100微升膜囊泡的等分，孵育5分钟。在1.5毫升微离质管中，将含有放射性标记多胺的缓冲液3加入，最终浓度为50微摩尔，加入膜囊泡，以启动运输。
在 12 摄氏度下进行运输检测一分钟。之后，将反应混合物转移到过滤歧管中，并通过0.45微米硝基纤维素膜过滤器进行过滤。加入三毫升的冰冷测定缓冲液，含有10倍高浓度的未标记聚胺，然后是三毫升的检测缓冲液，不含多胺，以减少非特异性结合。
将洗净的过滤器转移到含有 10 毫升闪烁液体的 20 毫升一次性闪烁小瓶中，并使用液体闪烁计数器确定放射性。计算文本协议中概述的聚胺净吸收。通过测量放射性标记基板的吸收到表达目标蛋白质的囊泡中，并使用非线性回归方法计算 Michaelis-Menten 动力学，确定基板的Km。
在竞争实验中，在检测缓冲液中添加在检测缓冲液中制成的非标记竞争性基板，在12摄氏度下加入含有100微升囊泡的离心管，同时添加50微摩尔的放射性标记聚胺。测量囊泡内捕获的放射性，如前所述。通过测量放射性标记聚胺的吸收和 100 微摩尔或更高无标记基材的存在，确定竞争基材的父KM，并使用非线性回归方法绘制曲线。
在这项研究中，抗波特的特点是首先在大肠杆菌中表达蛋白质，然后产生膜囊泡，使异源表达的蛋白质可以在无细胞系统中检测。西方的印迹用于验证 AtBAT1 是否被转定位到囊泡。用抗他的C-终端抗体探测印迹后，发现一种聚变构造蛋白约为72.3千吨。
SDS-PAGE 之前的囊泡消化导致减少，但探针信号没有完全丢失。在12摄氏度下，囊泡的放射性标记精激素在1分钟内最高，在三分钟内保持线性。因此，运输测定的孵化时间固定在一分钟。
一分钟后，由于囊泡膜上没有质子梯度，因此在pH 8.0中准备并储存的膜囊泡没有对同位素的净吸收。为了证明人工质子梯度的耗散效果，膜囊泡在添加标记基板之前在pH 8.0缓冲液中孵育10分钟，从而对放射性标记基板的吸收最小。综合起来，这些结果表明，质子驱动的精子酶的吸收是由于BAT1蛋白。
为了确定蛋白质的基底特异性，通过测量不同浓度的放射性标记基质的吸收率来计算 Km 值。精氨酸、聚氨基辛和精氨酸的Km值表明这种蛋白质是一种高亲和力的多胺和精氨酸交换器。通过使用竞争分析，也可以间接确定特定基材的运输器的亲和力。
这些测定表明，GABA是一种具有竞争力的精子素抑制剂。此外，测量50微摩尔放射性标记精氨酸在不同浓度的不同氨基酸存在的情况下的摄取量表明，AtBAT1也能够以毫摩尔浓度运输谷氨酸和丙氨酸。执行此过程时，膜传输器与细菌膜的集成显然至关重要。
验证感兴趣的蛋白质是否被集成到膜中，可以使用针对C-终端标签的抗体进行验证。人类运输者的基因变异可以影响代谢物和药物的运输，而代谢物和药物是特定运输者基质。因此，全药变异可以同时影响药物的吸收和排泄。
许多基因变异可以通过表达载体中传输器基因的侧向突变快速生成。然后，可以使用从内到外的囊泡测定，在非常可控的条件下测试这些变异的功能性检测。膜运输机占所有蛋白质的8到10个，而且大多数蛋白质在任何模型生物体中都未完全被描述。
局部到细胞膜的运输器在真核细胞中以异质表达来描述特别具有挑战性。如果交换类型或质子介质的运输器可以本地化到此大肠杆菌膜，这些运输器可以使用此体外测定功能特征。囊泡的质量和产量受到法国媒体细胞碎片的洗脱率的影响。
在用同位素进行囊泡的运输测定时，重要的是要有一个实验装置，促进实验复制。有许多方法可以做到这一点，但我们认为，这将有助于我们向您展示我们是如何做到这一点。
