אחד היתרונות העיקריים של טכניקה זו לאפיון מובילי ממברנה הוא שאתה יכול לקבוע את הזיקה היחסית של המשגר עבור מצעים ספציפיים, כמו גם לקבל תובנה על מנגנון התחבורה. האפיון של חלבוני קרום המשתמשים שיפוע חלבון כדי לנהוג הובלת מצעים מתאים במיוחד זה מקדם וריתוך החוצה שאנו מדגימים כאן. בעוד שחקירה זו דורשת ציוד מיוחד כגון עיתונות צרפתית וגישה לאולטרהצנטריפוגה, אנו חושבים שזה עשוי להיות קל יותר מבחינה טכנית מאשר בדיקות הדורשות הובלות קרום כדי להיות מחדש לתוך ליפוזומים מלאכותיים.
היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת לנו לכמת את הזיקה היחסית למצעים שונים ולעשות מבחן תחרות כדי לבחון את ההשפעה של מצעים מתחרים על סורגים תחבורה. במקרה של טרנספורטר BAT1 המשמש להמחשת הנחיה זו, הצלחנו גם להראות הפעלת מצע של המשגר על ידי ארגינין. כדי להתחיל בהליך זה, תרבות תאי מוטציה E.coli מוכן המבטאים את חלבון היעד על ידי חיסון מושבה אחת בחמישה מיליליטר של פוליאמין 3 מדיה עם אנטיביוטיקה מתאימה וגדל אותו לילה ב 37 מעלות צלזיוס.
למחרת, להעביר את התרבות הזאת 500 מיליליטר של פוליאמין טרי 3 מדיה כי הוא הוסיף עם 0.0002% arabinose ולגדול עד שתרבות התא מגיע OD600 של בין 0.6 ו 0.8. לאחר מכן, צנטריפוגה ב 2000 פעמים G וב ארבע מעלות צלזיוס במשך 15 דקות כדי לאסוף את גלולת התא. להשעות מחדש את גלולה ולשטוף אותו שלוש פעמים עם חיץ אחד על ידי צנטריפוגה ב 2000 פעמים G ו בארבע מעלות צלזיוס במשך 15 דקות בכל פעם.
הנפח הסופי של תאים במאגר אחד אחרי הסיבוב השלישי צריך להיות 10 מיליליטר. הגדר תא לחץ צרפתי 35 מיליליטר ויוצקים את ההשעיה התא לתוך הגוף של התא. הפעל את המחשב באמצעות המתג ב- RHS בחלק האחורי של היחידה והגדר את מתג בורר היחס כגבוה.
הפעל את מתג המשאבה. הבוכנה תתחיל לעלות מהבסיס כדי לעקור את האוויר בתא. להגביר את הלחץ על ידי הפיכת שסתום להגביר את הלחץ בכיוון השעון עד המד מגיע 640 PSI.
זה ייצור לחץ פנימי של 10,000 PSI. לאחר התא הגיע ללחץ היעד, לפתוח את הרכבה שסתום זרימה מעט על ידי הפיכתו נגד כיוון השעון. התאם את פתיחת השסתום כדי לאפשר קצב זרימה של כ -10 טיפות בלבד לדקה.
כאשר קו העצור בגוף הבוכנה מגיע לראש תא הזרימה, לכבות את מתג המשאבה. הנך את הלוח התחתון על-ידי מיקום מתג בורר היחס למטה ולאחר מכן, הגדרת מתג המשאבה. כאשר הצלחת התחתונה נסוגה לחלוטין, להפחית את לחץ המערכת לאפס על ידי הפיכת שסתום להגביר את הלחץ באופן מלא נגד כיוון השעון.
כבה את מתג המשאבה כבה את המחשב. צנטריפוגה העיתונות הצרפתית eluant ב 10, 000 פעמים G וב ארבע מעלות צלזיוס במשך 15 דקות כדי להסיר תאים שבורים ופסולת תאים. השליכו את גלולת הכדור והעברו את העל-טבעי לצינורות אולטרה-מרכזיים.
Ultracentrifuge העל וכתוצאה מכך ב 150, 000 פעמים G ו ב 4 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת כדי גלולה ורי הווסיקים קרום. לשטוף את ורי הממברנה פעם אחת ללא השעיה מחדש במאגר 2. לאחר מכן, השתמש מטחנת רקמת Dounce כדי להשעות מחדש את ארס הממברנה במאגר 2.
הכינו 100 אליקוטים מיקרוליטרים של ההכנות לממברנה בצינורות צנטריפוגה 1.5 מיליליטר ואחסנו אותם במינוס 80 צלזיוס. ראשית, לשטוף ולהשעות מחדש את ורידים ב 30 מילימולר של טריס ב pH 7.8, המכיל 0.1 מילימולר של קובלט II כלוריד. הוסף מיקרוליטר אחד של carboxypeptidase A נתרן כלורי, טריס, קובלט II כלוריד לכל מדגם 100 microliter.
דגירה ב 20 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות. הוסף חמישה microliters של פתרון המכיל נתרן EDTA ו 2-Mercaptoethanol ב PH 7.5 כדי לעצור את העיכול. להדק את הפתרון בטמפרטורת החדר במשך שעה אחת כדי להשבית לחלוטין את האנזים.
לאחר מכן, להוסיף בין חמישה ל 10 microliters של פתרון המכיל ליתיום dodecyl סולפט, גליצרול, ברומופניול כחול, ו טריס ב pH 7.5 כדי 100 microliters של המדגם ולנתח דגימות על ידי אלקטרופורזה. כדי לבצע סופג אמינו, להניח מסנן nitrocellulose לח עם 25 מילימולר נתרן מימן פוספט על ג'ל פוליאקרילמיד. מניחים אותם בין שני מסנני תאית לחים, ולבסוף, בין שני רפידות סריקת פלסטיק לחות.
מניחים את המכלול הזה בין האלקטרודות של תא המכיל 25 מילימולר נתרן מימן פוספט בטמפרטורה שבין שתיים לארבע מעלות צלזיוס. אלקטרונים מפעימות את החלבונים ב-20 וולט וב-2-3 אמפר למשך שלוש שעות. לחסום את קרום nitrocellulose בחסימת חיץ לילה בשתי מעלות צלזיוס.
למחרת, דגירה nitrocellulose ב 20 מיליליטר של אחד עד 5, 000 דילול של נוגדן HRP C-מסוף שלו חוצץ חסימה במשך שעתיים לשטוף פעמיים עם 50 מיליליטר של חיץ במשך סך של 60 דקות. כדי לדמיין את כתם האמינו, להמיס שישה מיליגרם של 4-כלורו-1-naphthol ב 20 מיליליטר של אלכוהול denatured ולהוסיף 80 מיליליטר של 15 מילימולרים טריס ו 50 microliters של 30% מי חמצן. לרחוץ את נייר המסנן בתסומה זו מצע במשך 20 דקות.
כאשר התפתח צבע מספיק, שוטפים את הממברנה במים ומאפשרים לה להתייבש. כדי להתחיל, דגירה 100 aliquot microliter של ורי ממברנה ב 12 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. הוסף מאגר 3 המכיל פוליאמינים radiolabeled בריכוז סופי של 50 מיקרומולרים וריסקי הממברנה ב 1.5 צינורות מיקרוצנטריפוגה מיליליטר ליזום תחבורה.
נהל את הובלה ב 12 מעלות צלזיוס לדקה אחת. לאחר מכן, להעביר את תערובות התגובה לסעפת סינון ולסנן אותו דרך מסנן קרום חנקן 0.45 מיקרומטר. הוסף שלושה מיליליטר של חיץ אשד קר כקרח המכיל ריכוז גבוה פי עשרה של פוליאמינים ללא תווי קרח, ואחריו שלושה מיליליטר של חיץ התזה ללא הפוליאמינים כדי להפחית את הכריכה הלא ספציפית.
מעבירים את המסננים השטופים ל-20 בקבוקונים חד פעמיים חד פעמיים המכילים 10 מיליליטר של נוזל תכלת, ולהשתמש בדלפק תבליט נוזלי כדי לקבוע את הרדיואקטיביות. חשב את ספיגת הפוליאמין נטו כמתואר בפרוטוקול הטקסט. לקבוע את הק"מ עבור המצע על ידי מדידת ספיגת מצע radiolabeled לתוך וויסקלים המבטאת את חלבון היעד ולחשב את קינטיקה מיכאליס-מינטן בשיטת רגרסיה לא ליניארית.
לניסויי התחרות, הוסיפו את המצע התחרותי שאינו מסומן במאגר ההתרשמות לצינור הצנטריפוגה המכיל 100 מיקרוליטרים של יבלות ב-12 מעלות צלזיוס ובו זמנית הוסיפו 50 מיקרומולרים של הפוליאמין עם הבליטה. למדוד את הרדיואקטיביות לכוד בתוך ורייקים כפי שתואר קודם לכן. לקבוע KM הורה עבור מצעים תחרותיים על ידי מדידת ספיגת פוליאמינים radiolabeled ואת הנוכחות של 100 micromolar או מצע לא שכותרתו גבוהה יותר ולהשתמש בשיטת רגרסיה לא ליניארית כדי להתוות את העקומה.
במחקר זה, אנטי סבל מאופיין תחילה על ידי הבעת החלבון ב- E.coli, ולאחר מכן, יצירת ורי ורי ממברנה, כך החלבון לידי ביטוי הטרולוגית ניתן להתביג במערכת ללא תאים. כתם מערבי משמש כדי לוודא כי AtBAT1 הוא טרנסלוקציה לוורס. בדיקת הכתם בנוגדן אנטי-מסוף C שלו גילתה חלבון מבנה היתוך שהוא כ-72.3 קילודלטונים.
עיכול של ורידים לפני SDS-PAGE הביא לירידה, אבל לא אובדן מוחלט של אות החללית. ב 12 מעלות צלזיוס, ספיגת זרע radiolabeled על ידי הווסיקים הוא הגבוה ביותר בדקה אחת ונשאר ליניארי על פני שלוש דקות. לכן, זמן הדגירה של מתקן ההובלה קבוע בדקה אחת.
לאחר דקה אחת, אין ספיגת נטו של איזוטופ על ידי ורי ממברנה שהוכנו ומאוחסנים ב- pH 8.0 מכיוון שאין שיפוע פרוטונים על פני קרום הווסקל. כדי להדגים את ההשפעה של פיזור של שיפוע פרוטון מלאכותי, ורי הווסיקים קרום הם דגירה pH 8.0 חיץ במשך 10 דקות לפני הוספת מצע שכותרתו, המוביל ספיגה מינימלית של מצע radiolabeled. יחד, תוצאות אלה מצביעות על כך ספיגה מונחה פרוטון של זרע נובע חלבון BAT1.
כדי לקבוע את הספציפיות של המצע של החלבון, ערכי ק"מ מחושבים על ידי מדידת ספיגת מצע radiolabeled בריכוזים שונים. ערכי ק"מ עבור זרע, putrescine, ארגינין עולה כי חלבון זה הוא פוליאמין זיקה גבוהה מחליף ארגינין. אהדה של המשגר למצע מסוים יכולה להיקבע בעקיפין גם באמצעות מרשם תחרות.
אלה assays לחשוף כי גאבא הוא מעכב תחרותי של זרע. יתר על כן, מדידת ספיגת 50 micromolar של זרע radiolabeled בנוכחות ריכוזים משתנים של חומצות אמינו שונות מגלה כי AtBAT1 הוא גם מסוגל להעביר גלוטמט ואלנין בריכוזים מילימולרית. בעת ביצוע הליך זה, השילוב של טרנספורטר הממברנה לתוך קרום חיידקי הוא, כמובן, קריטי.
אימות כי חלבון העניין משולב בקרום יכול להיעשות באמצעות נוגדנים המכוונים נגד תגי C-terminal. וריאציה גנטית של מובילים אנושיים יכולה להשפיע על ההובלה של, שניהם, מטבוליטים ותרופות כי הם מצעים של טרנספורטר מסוים. לכן, וריאציה allelic יכול להשפיע, הן, ספיגה הפרשה של תרופות.
גרסאות אליליות רבות יכולות להתבצע במהירות על ידי מוטגנסיס מכוון צדדית של גן המשגר בווקטור ביטוי. לאחר מכן ניתן לבדוק בדיקות פונקציונליות של גרסאות אלה בתנאים מבוקרים מאוד באמצעות בדיקות ווסקליות מבפנים החוצה. טרנספורטרים ממברנה מהווים שמונה עד 10 של כל החלבונים ורובם לא התאפיינו לחלוטין באף אחד האורגניזמים מודל.
מובילים מקומיים קרום organelle מאתגרים במיוחד לאפיין על ידי ביטוי הטרולוגי בתאים אוקריוטיים. אם ניתן להפוך את משגרי ההחלפה או המשגרים בניווי הפרוטון לממברנה זו של E.coli, ניתן לאפיין מובילים אלה באופן פונקציונלי באמצעות הבטחה זו במבחנה. האיכות והתפוקה של זיקיקים מושפעת מקצב האלוטיון של שברי תאים מהעיתונות הצרפתית.
בעשיית בדיקות תחבורה של וריקלים עם איזוטופים, חשוב שיהיה מערך ניסיוני המאפשר ביצוע שכפולים ניסיוניים. ישנן דרכים רבות לעשות זאת, אך אנו חושבים שזה יעזור לנו להראות לך כיצד עשינו זאת.
