멤브레인 수송기를 특성화하기위한이 기술의 주요 장점 중 하나는 특정 기판에 대한 수송기의 상대적 선호도를 결정할 뿐만 아니라 운송 메커니즘에 대한 통찰력을 얻을 수 있다는 것입니다. 기판 수송을 구동하기 위하여 단백질 그라데이션을 사용하는 막 단백질의 특성은 우리가 여기에서 설명하는 이 안쪽 아웃 소포 분석에 특히 적합합니다. 이 분석법은 프랑스 언론과 같은 일부 특수 장비와 초원심분리기에 대한 접근이 필요하지만, 멤브레인 수송기를 인공 리포솜으로 재구성해야 한다는 분석보다 기술적으로 더 쉬울 수 있다고 생각합니다.
이 기술의 주요 장점은 우리가 다른 기판에 대한 상대적 친화성을 정량화하고 운송 화격자에 경쟁 기판의 효과를 테스트하기 위해 경쟁 분석을 할 수 있다는 것입니다. 이 분석방법을 설명하는 데 사용되는 BAT1 수송기의 경우, 우리는 또한 아르기닌에 의해 수송기의 기판 활성화를 표시 할 수 있었다. 이 절차를 시작하기 위해, 적절한 항생제를 가진 폴리 아민 3 배지의 5 밀리리터에서 단일 식민지를 접종하고 섭씨 37도에서 하룻밤 을 성장시킴으로써 표적 단백질을 표현하는 준비된 대장균 돌연변이 세포를 배양합니다.
다음날, 이 문화를 신선한 폴리아민 3 배지의 500밀리리터로 옮기고 0.0002%의 아라비노스로 보충되어 세포 배양이 0.6~0.8의 OD600에 도달할 때까지 성장한다. 그 후, 원심분리기는 2000배 G에서, 섭씨 4도에서 15분 동안 세포 펠릿을 수집한다. 펠릿을 다시 일시 중단하고 버퍼로 3회 세척하여 2000회 G에서 원심분리하고 매번 섭씨 4도에서 15분간 세척합니다.
세 번째 스핀 후 버퍼 1의 마지막 셀 볼륨은 10 밀리리터여야 합니다. 35 밀리리터 프렌치 압력 셀을 설정하고 셀의 본체에 세포 현탁액을 붓습니다. 장치 뒷면의 RHS스위치를 사용하여 기기를 켜고 비율 선택기 스위치를 높게 설정합니다.
펌프 스위치를 켭니다. 피스톤은 기지에서 일어나 챔버의 공기를 대체하기 시작합니다. 게이지가 640 PSI에 도달할 때까지 압력 증가를 시계 방향으로 돌이면서 압력을 증가시면 압력을 증가시면 됩니다.
이렇게 하면 10, 000 PSI의 내부 압력이 생성됩니다. 셀이 목표 압력에 도달하면 시계 반대 방향으로 전환하여 유동 밸브 어셈블리를 약간 엽니다. 밸브의 개구부를 조정하여 분당 약 10방울의 유속을 허용합니다.
피스톤 본체의 정지 선이 유동 셀의 상단에 도달하면 펌프가 꺼지게 됩니다. 비율 선택기 스위치를 아래로 배치한 다음 펌프 스위치를 켜서 하단 플레이트를 낮춥습니다. 바닥 플레이트가 완전히 철회되면 압력 증가 밸브를 시계 반대 방향으로 완전히 돌려 시스템 압력을 0으로 줄입니다.
펌프 스위치를 끄고 기기를 끕니다. 원심 분리기 는 10, 000 배 G와 4 섭씨에서 15 분 동안 깨진 세포와 세포 파편을 제거합니다. 펠릿을 버리고 상체를 초원심분리기 튜브로 옮기십시오.
초음파 는 150, 000 배 G와 4 섭씨에서 1 시간 동안 막 소포를 펠렛으로 생성 된 상체를 생성합니다. 완충 2에서 다시 현탁액없이 멤브레인 소포를 한 번 씻으하십시오. 그런 다음, Dounce 조직 분쇄기를 사용하여 완충 제 2에서 막 소포를 다시 일시 중단하십시오.
1.5 밀리리터 원심분리기 튜브에 멤브레인 제제의 100 마이크로리터 알리쿼트를 준비하고 영하 80°C에 보관하십시오. 먼저, 코발트 II 염화물의 0.1 밀리몰라를 포함하는 pH 7.8에서 트리스의 30 밀리머에서 소포를 세척하고 다시 중단합니다. 염화나트륨, 트리스, 코발트 II 염화물 1마이크로리터를 100마이크로리터 샘플에 첨가합니다.
섭씨 20도에서 20분간 배양하세요. 소화를 막기 위해 EDTA 나트륨과 2-Mercaptoethanol을 포함하는 용액의 5마이크로리터를 PH 7.5에 추가합니다. 효소를 완전히 비활성화하기 위해 실온에서 1 시간 동안 용액을 배양하십시오.
다음으로, 리튬 도데실 황산염, 글리세롤, 브로모페놀 블루, 트리스를 포함하는 용액의 5~10마이크로리터를 pH 7.5~100 마이크로리터에 추가하고 전기포뇌증에 의한 샘플을 분석한다. 아미노 블로팅을 수행하려면 폴리아크릴라미드 젤에 25밀리머 나트륨 인산염으로 촉촉한 니트로셀룰로오스 필터를 놓습니다. 촉촉한 셀룰로오스 필터 두 개와 마지막으로 촉촉한 두 개의 플라스틱 수색 패드 사이에 배치합니다.
25 밀리머 나트륨 인산염을 포함하는 챔버의 전극 사이에이 조립을 2 섭씨 와 4 섭씨 사이의 온도에 놓습니다. 단백질을 20볼트에서 3시간 동안 2~3암페어로 전기전달합니다. 하룻밤 동안 완충을 차단하는 니트로셀룰로오스 멤브레인을 2도에서 차단하십시오.
다음 날, 니트로셀룰로오스를 1-5, 000의 안티-그의 C-말단 HRP 항체의 희석20밀리리터에 배양하고 버퍼를 2시간 동안 차단하고 총 60분 동안 50밀리리터의 완충제로 두 번 세척한다. 아미노 블롯을 시각화하려면 4-클로로-1-나프톨 6밀리그램을 변성 알코올 20밀리리터에 녹이고 15밀리머 트리의 80밀리리터와 과산화수소 30%의 마이크로리터 50밀리리터를 추가합니다. 이 기판 용액에 필터 용지를 20분 동안 바치면 됩니다.
충분한 색상이 개발되면 멤브레인을 물로 헹구고 건조시키십시오. 시작하려면 100 마이크로리터 알리쿼트의 멤브레인 소포를 섭씨 12도에서 5분간 배양합니다. 1.5 밀리리터 미세원심분리기 튜브에서 멤브레인 소포에 50 마이크로몰러의 최종 농도에서 방사성 표지폴리아민을 함유한 완충제 3을 추가하여 수송을 개시한다.
1 분 동안 섭씨 12도에서 교통 분석을 수행하십시오. 그 후, 반응 혼합물을 여과 매니폴드로 옮기고 0.45 마이크로미터 니트로셀룰로오스 멤브레인 필터를 통해 필터링한다. 라벨이 부착되지 않은 폴리아민의 10배 더 높은 농도를 포함하는 얼음-차가운 분석 버퍼 3개, 폴리아민이 없는 3밀리리터의 분석 버퍼를 추가하여 특이적이지 않은 결합을 줄입니다.
세척된 필터를 10밀리리터의 신경액을 함유한 일회용 신경환 바이알로 옮기고, 액체 신경화 카운터를 사용하여 방사능을 결정합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 순 폴리아민 섭취량을 계산합니다. 표적 단백질을 발현하는 소포로 방사성 표지기기의 섭취를 측정하여 기판에 대한 Km을 결정하고 비선형 회귀 방법을 사용하여 Michaelis-Menten 운동학을 계산한다.
경쟁 실험의 경우, 분석 버퍼에서 만든 비표지 경쟁 기판을 12도에서 100 마이크로리터의 소포를 포함하는 원심분리기 튜브에 추가하면서 동시에 방사성 표지 폴리아민의 50 마이크로몰라를 추가한다. 이전에 설명한 대로 소포 내부에 갇힌 방사능을 측정합니다. 방사성 표지폴리아민의 섭취와 100마이크로몰러 이상의 비표지기판의 존재를 측정하여 경쟁기판에 대한 부모 KM을 결정하고 비선형 회귀 방법을 사용하여 곡선을 플롯한다.
본 연구에서는, 항 포터는 먼저 대장균에서 단백질을 발현한 다음, 이종성 발현 단백질이 세포 없는 시스템에서 분석될 수 있도록 막 소포를 생성하는 것이 특징입니다. 서쪽 얼룩은 AtBAT1이 소포로 전이되는지 확인하는 데 사용됩니다. 항-그의 C-말단 항체로 블롯을 프로빙하면 약 72.3킬로달톤인 융합 생성 단백질을 드러냈다.
SDS-PAGE 이전에 소포의 소화로 인해 프로브 신호가 완전히 손실되지는 않았지만 감소는 초래되었습니다. 섭씨 12도에서 소포에 의한 방사성 라벨이 부착된 정자를 1분에 가장 높고 3분 이상 선형으로 유지됩니다. 따라서, 수송 분석의 인큐베이션 시간은 1분에 고정된다.
1 분 후, 소포 막에 걸쳐 양성자 그라데이션이 없기 때문에 pH 8.0에 준비되고 저장된 멤브레인 소포에 의해 동위원소의 순 조리가 없습니다. 인공 양성자 그라데이션의 소멸 효과를 입증하기 위해 멤브레인 소포는 표지된 기판을 첨가하기 전 10분 동안 pH 8.0 버퍼로 배양되어 방사성 라벨이 부착된 기판의 최소한의 섭취로 이어진다. 종합하면, 이러한 결과는 정액의 양성자 구동 섭취량이 BAT1 단백질 때문임을 나타냅니다.
단백질의 기판 특이성을 결정하기 위해 Km 값은 상이한 농도에서 방사성 표지기기의 섭취를 측정하여 계산됩니다. 정자, putrescine 및 아르기닌에 대한 Km 값은이 단백질이 높은 친화성 폴리 아민및 아르기닌 교환기임을 나타냅니다. 특정 기판에 대한 수송기의 선호도는 또한 경쟁 적 애사를 사용하여 간접적으로 결정될 수 있다.
이러한 assays 는 GABA가 정자의 경쟁 억제제임을 밝힙시다. 또한, 다른 아미노산의 다양 한 농도의 존재에 방사성 라벨 된 정자의 50 마이크로 몰러의 섭취를 측정 AtBAT1 또한 밀머 농도에서 글루타민트와 알라닌을 수송 할 수 있음을 밝혀. 이 절차를 수행할 때 멤브레인 수송기를 세균 막에 통합하는 것은 분명히 매우 중요합니다.
관심 있는 단백질이 막내로 통합된다는 검증은 C-말단 태그에 대하여 지시된 항체를 사용하여 행해질 수 있다. 인간 수송기의 유전 적 변이는 특정 수송기의 기판인 대사 산물 및 약물의 수송에 영향을 미칠 수 있습니다. 따라서, 알꼴 변이는 약물의 흡수와 배설에 영향을 미칠 수 있다.
많은 색인종 변이체는 발현 벡터에서 수송 유전자의 측면 지향 돌연변이 발생에 의해 신속하게 이루어질 수 있다. 이러한 변종의 기능적 소는 내부 아웃 소포 스캔을 사용하여 매우 통제 된 조건에서 테스트 할 수 있습니다. 멤브레인 수송기는 모든 단백질의 8-10을 구성하고 대다수는 모형 유기체의 전부에서 완전히 특징지지 않았습니다.
세포막에 국한된 수송기는 진핵 세포에서 이종 발현을 특징으로 하는 것이 특히 도전적입니다. 교환 유형 또는 양성자 매개 수송기는 이 대장균 멤브레인에 국한될 수 있는 경우, 이러한 수송기는 시험관 내 분석에서 이를 사용하여 기능적으로 특징화될 수 있다. 소포의 품질과 수율은 프랑스 언론의 세포 조각용출률에 의해 영향을 받습니다.
동위원소와 소포의 전송 assays를 수행에서, 실험 복제를 용이하게 실험 설정을하는 것이 중요합니다. 이 작업을 수행하는 방법에는 여러 가지가 있지만, 우리는 우리가 어떻게 했는지 보여주는 것이 도움이 될 것이라고 생각합니다.
